酵母菌的分离及培养条件的优化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二组,实验,设计型实验 酵母菌的分离及培养条件的优化,一、目的要求,1,、掌握培养基的配置及灭菌方法，能够正确的配制 培养基并在高压灭菌锅内进行灭菌。,2,、熟知培养基成分的选择原则，能够对培养基的成分和配比进行优化设计。,3,、掌握固体斜面、平板的制备技术，能够通过划线、涂布等方法分离菌种。,4,、熟知影响酵母菌生长繁殖各种培养条件，能够对摇瓶培养条件进行优化设计。,5,、了解酵母菌培养过程的代谢变化规律。掌握酵母菌培养过程参数的测定和分析方法。,二、基本原理,酵母菌是单,细胞,真菌生物，具有很高的营养价值，特别是含有较多蛋白质、,B,族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物。因酵母属于简单的单,细胞,真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。是遗传工程研究过程中常用的受体菌种。从自然界或商品中分离纯的酵母菌株，通常采用平板或斜面涂布划线法。这两种方法简单有效，是实验室分离纯化菌种常用到的方法。,在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的菌体浓度、残留的还原糖等参数，动态地了解发酵过程中过程变量的变化，分析菌体生长、基质消耗、产物生成的速度，研究发酵动力学，为生产中优化培养条件提供数据依据。,三、实验材料,（一）菌种：,从安琪酵母中分离的酵母菌,（二）培养基,基础培养基,YPD,：,酵母浸粉,1%,蛋白胨,2%,葡萄糖,2%,固体培养 基再加琼脂,2%,优化,N,源培养基：,酵母浸粉,1% (NH4)2SO4 2%,葡萄糖,2%,；,酵母浸粉,1% (NH4)2SO4 4%,葡萄糖,2%,；,酵母浸粉,1% NH4NO3 2%,葡萄糖,2%,；,酵母浸粉,1% NH4NO3 4%,葡萄糖,2%,；,酵母浸粉,1% NaNO3 2%,葡萄糖,2%,；,酵母浸粉,1% NaNO3 4%,葡萄糖,2%,；,（三）仪器设备,超净工作台，,756,型分光光度计，旋转式摇床，恒温培养箱，全自动灭菌锅，三角瓶、涂布器、移液管、平皿等玻璃仪器。,（四）试剂,酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂,(NH4)2SO4 2%,、,(NH4)2SO4 4%,、,NH4NO3 2% NH4NO3 4%,、,NaNO3 2%,、,NaNO3 4%,等；裴林试剂甲液、裴林试剂乙液；,NaOH,溶液、,HCl,等。,四 实验内容,1,、分离单菌落,（,1,）实验物品灭菌,仪器：包扎,9,个移液管、,9,个涂布器、,9,个装有,9ml,蒸馏水的试管、,16,个平板、,液体：,3g,酵母浸粉,1%,、,6g,蛋白胨,2%,、,6g,葡萄糖,2%,，配成,300ml,溶液，取,240ml,溶液平均分装两个三角瓶中，然后每个三角瓶放入,2.4g,琼脂，剩下,60ml,为液体培养基，然后将以上设备拿去灭菌,（,2,）划线涂布,超净台上：,1,、把,240ml,的培养基分别倒入,15,个平板，每个平板为,1213ml,，平板分别标,10-210-10,，还有倒一个斜面,2,、取,1ml,的菌原液进行稀释梯度为,10-310-10,3,、划线涂布,划线为原液,从,10-210-7,；涂布从,10-310-10,用对应的稀释梯度液，,10-2,用原液涂布,2,、种子培养,挑取单菌落接至种子瓶，进行种子培养,培养条件：将,250ml,三角瓶装培养基,60ml,放入摇床，将转速为,180r/min,温度为,30,度,培养时间,:12,月,4,号早上,10:37,到,12,月,5,号早上,8:47,十,个小时左右,氮源的优化方案,1.,常见的有机氮源,2.,准备,7,个三角瓶分别装入以下培养基然后定容至,50ml,1.,酵母浸液,0.5g (NH4)2SO4 1g,葡萄糖,1g,2.,酵母浸液,0.5g (NH4)2SO4 2g,葡萄糖,1g,(2) 1.,酵母浸液,0.5g NH4NO3 1g,葡萄糖,1g,2.,酵母浸液,0.5g NH4NO3 2g,葡萄糖,1g,(3) 1.,酵母浸液,0.5g NaNO3 1g,葡萄糖,1g,2.,酵母浸液,0.5g NaNO3 2g,葡萄糖,1g,3.,对比试验,:,酵母浸液,0.5g,蛋白胨,1g,葡萄糖,1g,4.,配置完毕调,PH,值,PH,等于,5,为准确,包三个移液管然后将以上培养基一起拿去灭菌,接种培养,将种子液按,9%,的接种量接种到以下发酵瓶中,（,NH,4,）,2,SO,4,2%+5ml,种子液,（,NH,4,）,2,SO,4,4%+5ml,种子液,NH,4,NO,3,2%+5ml,种子液,NH,4,NO,3,4%+5ml,种子液,NaNO,3,2%+5ml,种子液,NaNO,3,4%+5ml,种子液,蛋白胨,+5ml,种子液,培养,时间,9,：,20,条件,180r/min 30,的摇床,测种子液的,OD,值,将种子液稀释,10,倍，以,YPD,培养液为标准液测其,OD,值,测得,OD,值,17.2%T,取样,两小时后（,11,：,20,）,PH,值均为,6,OD,值,:,稀释,10,倍 原液,(NH4)2SO4 2% 0.117A 1.018A,(NH4)2SO4 4% 0.105A 0.863A,NH4NO3 2% 0.097A 0.889A,NH4NO3 4% 0.061A 0.830A,NaNO3 2% 0.130A 0.845A,NaNO3 4% 0.143A 0.836A,对照,0.178A 1.180A,测发酵瓶的,PH,值,OD,值及残糖量,一小时后（,12,：,30,）,PH,值均为,5,OD,值,稀释 原液,（,NH4,）,2SO4 2% 0.210A 1.066A,（,NH4,）,2SO4 4% 0.167A 0.939A,NH4NO3 2% 0.192A 1.036A,NH4NO3 4% 0.106A 0.833A,NaNO3 2% 0.167A 1.092A,NaNO3 4% 0.161A 1.102A,对比,0.262A 1.328A,残糖量,空白,费林试剂,A5ml+,费林试剂,B5ml+10ml,水,+6ml,标准葡萄糖,样品,费林试剂,A5ml+,费林试剂,B5ml+10ml,水,+0.5ml,样品,测定结果 消耗标准葡萄糖 残糖量,（,NH,4,）,2,SO,4,2% 7.08ml 1.744%,（,NH,4,）,2,SO,4,4% 6.5ml 1.86%,对比,6.98ml 1.764%,结论,1,、 经观察菌种生长发现稀释梯度为,10-8,、,10-9,的菌种进行涂布生长较好,2,、 有机氮源比无机氮源效果好,(NH4)2SO4,比,NH4NO3,、,NaNO3,效果好,（,NH4,）,2SO4 2%,比,（,NH4,）,2SO4 4%,效果好,实训,一、实训要求,1,、,YPT,培养基：酵母菌,1%,，蛋白胨,2%,葡萄糖,2%,；,2,、灭菌装料量,60%,；,3,、设定参数：,PH=5,，,T=30,，转速,180r/min;4,、接种与培养（接种量,10%,）注,：（,1,）发酵罐是否正常运行、各参数；（,2,）随时间的延长适当调进气量、搅拌速度；（,3,）取样,30min/,次、镜检,2h/,次，样品进行两个平板培养。,二、配制,1,、配多少培养基,10L,罐装料量,60%,：,10X60%=6L,接种量,10%,：培养基,5400ml(,实际操作培养基,5000ml),，种子液,600ml,2,、配方用多少,6L:60g,酵母浸粉,1%,120gc120g,葡萄糖,2%,；,150ml:1.5g,酵母浸粉,1%,3g,酵母浸粉,1%,3g,葡萄糖,2%.,其中,100ml,加,1g,琼脂配成固体培养基用于倒平板；,50g,原液用于测,OD,时做标准液。,3,、所需器材包扎灭菌,4,个装有,9ml,蒸馏水的试管，,6,个空试管，,4,个涂布器，,4,个移液管,1ml,，,6,个平板,1,、,NB,型空气过滤器消毒,1.1,在发酵罐空消前，必须对设备的,NB,型过滤器先进行消毒；,1.2,为防止蒸汽冷凝水进入,NB,型过滤器，消毒前必须先打开过滤器底部的排污阀，排尽冷凝水，时间控制不少于,5min,；,1.3,NB,型过滤器的消毒温度控制在,120-123,之间，压力维持在之间，时间确保在,25min-30min,之间；,1.4,消毒后，在关闭蒸汽阀的同时迅速打开过滤器的进气阀换气，并用压缩空气将过滤器吹干，吹干时间一般控制在,25min-30min,之间；,1.5,吹干后，必须对整个空气进气系统进行保压，压力维持在之间。,操作注意：空气流量计内不能通入蒸汽，,NB,过滤器消毒前必须将空气流量计出口阀关闭，以免造成设备损坏。,2,、设备空消,2.1,空消前，将控制系统退出自动运行状态，小心取出,PH,电极和,DO,电极，进行清洗、校检、备用，并装好电极堵头。,2.2,打开夹套排污阀，同时打开夹套蒸汽阀进汽，在同时向罐内排光冷凝水之后，关闭夹套蒸汽阀，直至空消结束。,2.3,缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀进汽，待压力升至,0.01Mpa,后，打开罐面排气阀进行排气。,2.4,调节罐面排气阀，保持罐压,0.01Mpa,维持温度在,120125,之间，计时空消,30min,2.5,空消完毕，关闭进气阀及底阀处的蒸汽阀，打开底阀开始排污。,2.6,开大罐面排气阀，卸去罐压后，打开罐盖上的进料口加入培养基。,3,、加培养基,3.1,投料前，应校正并安装,PH,电极和,OD,电极。,3.2,按工艺要求配置好培养基原液，加入发酵罐内。,3.3,加水定容至,60%-65%,左右后，启动电机搅拌,5min,3.4,按工艺要求调整好,PH,后，拧紧进料口螺盖。,操作注意；实消时蒸汽冷凝水约占培养基体积,10%,左右，固定容是必须扣除此容积。,4,、培养基实消,4.1,投料结束后，启动电机。慢速搅拌。,4.2,微开夹套排污阀，打开夹套蒸汽阀，保持夹套压力为,0.11mpa,左右，待培养基预热达到,95,以上时停搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污阀。,4.3,培养基温度达到,95 ,后，缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀，同时向罐内进气，待罐压升至,0.11mpa,后，打开罐面排气阀进行排气。,4.4,调节罐面排气阀，保持罐压,0.11mpa,，维持温度,121 -123,之间，计时实消,20min,。,4.5,实消完毕，关闭底阀后关闭底阀处的蒸汽阀。,4.6,在关闭进气阀处的蒸汽阀的同时打开,NB,型过滤器的出气阀，进行换气，保持罐压之间。,4.7,关闭夹套排污阀后，迅速打开夹套手动进水阀和夹套排污阀进行降温，当培养基温度降到,90,左右时，开搅拌低速控制。,4.8,当培养基温度达到发酵需要的温度后，关闭夹套手动进水阀，调整转速至正常转速，将控制系统切换至自动；运行状态，调整进风量、罐压，等待接种。,操作注意；因为调压过滤器出口空气压力在之间，所以必须在发酵罐压力降至,0.1mpa,以下时方可进行唤起操作，且必须先换气后降温，防止设备失压。,5,、接种,5.1,准备好合格的摇床菌种，接种量根据工艺要求确定。,5.2,用,75%,酒精棉球擦洗进料口四周后，搁上接种火圈，并在接种火圈内围上酒精棉球，接种者双手也需用酒精棉球擦洗消毒。,5.3,减少进气量，控制罐压在,0.02MPa,左右后，点燃接种火圈内的酒精棉球。,5.4,拧下进料口螺盖，放入盛有酒精的培养皿中。,5.5,将接种瓶是瓶口在火焰上烧一下，并在火焰的保护下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。,5.6,旋上进料口螺盖后灭火焰，拧紧螺盖，并用酒精棉球将进料口擦洗干净。,5.7,重新调整进风量，保持罐压在,0.05MPa,。,注意事项：操作中动作要迅速，罐压不得跌零，否则会导致染菌。,6,、取样,6.1,打开取样放料阀处的蒸汽阀，微开取样放料阀，保持,10min,后关闭两阀门。,6.2,打开底阀和取样放料阀，放出少量培养液后关闭取样放料阀。,6.3,用酒精火焰封取取样放料口，把无菌取样瓶口置于酒精火焰上拔去瓶盖，打开取样放料阀取好样后，立即盖上瓶盖同时关闭底阀。,6.4,再次打开取样处放料阀处的蒸汽阀，对取样放料阀口再灭菌，保持时间,10min,后关闭两阀。,注意事项：若不需要取无菌样时，可不进行酒精火焰保护的操作。整个培养过程的总取样量一般不超过发酵液体积的,10%,，否则诸如氧传递速度等会受到影响。,7,、出料,7.1,调小罐面排气阀，调节进气阀，将罐压升至,0.05MPa0.1MPa,之间。,7.2,打开底阀和放料阀，使发酵液通过放料管放到盛料容器或下一道工序。,7.3,如发酵失败，必须将发酵液灭活后方可排除。,时间,PH,值,原液,OD,稀释,10,倍,OD,残糖量,09:18,5,0,、,735,0,、,102,09:48,6,0,、,815,0,、,199,10:17,6,0,、,799,0,、,143,10:47,6,0,、,873,0,、,144,11:18,6,0,、,857,0,、,133,11:47,6,0,、,848,0,、,127,12:17,6,0,、,836,0,、,157,12:47,6,0,、,821,0,、,175,01:17,6,0,、,870,0,、,161,01:47,6,0,、,936,0,、,167,谢谢,