淀粉酶活力的测定

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验七淀粉酶活力的测定,一、实验目的,掌握测定淀粉酶活力的,原理,和,基本方法,二、实验原理,酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能力的大小用,酶的活力,来表示。酶活力也称酶活性，是以酶在,最适温度,、,最适,pH,等条件下，催化一定的化学反应的,初速度,来表示。,本实验是以一定量的,-淀粉酶液，于37,、pH6.8的条件下，在一定的,初始作用时间,内将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力,这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37,、pH6.8的条件下，,每分钟,水解淀粉生成,1 mg还原糖,所需要的,酶量,。,1 U=1 mg 还原糖/minmL 酶,三.实验材料及设备,1、材料 淀粉酶液（,粗酶液、盐析液、脱盐液,）,2、仪器 分光光度计恒温水浴沸水浴,3、器材,刻度,试管：25 mL,17,移 液 管：,1 mL3（取稀释后的酶液）,烧 杯： 250 mL1,滴 管： 2,洗耳 球： 2,洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1,移 液 器：专取NaOH,注 射 器：专取蛋白样品,四、试剂的配制,1、淀粉溶液（0.5%）,称取5 g可溶性淀粉，溶于1000 mL热水中。,2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）,3、磷酸缓冲液（ 0.1 mol/L，pH6.8 ），,含0.3% NaCl,4、NaOH溶液（2.5mol/L）,五.操作步骤,1、淀粉酶的制备,（1）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗,酶提取液解冻，取上清液,0.05 mL,，加蒸馏水稀释到,25 mL,，摇匀备用,（2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析蛋白质解冻，取上清液,0.05 mL,，加蒸馏水稀释到,25 mL,，摇匀备用,（3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取,0.05 mL,，稀释。,收集1管的同学，将0.05 mL稀释到,15 mL,收集2管的同学，将0.05 mL稀释到,10 mL,试管排列顺序,空白,F1,B3,B2,F3,F2,F1,B3,B2,B1,F3,F2,1,淀粉,3,2,B1,粗酶液,盐,析,脱 盐,0 时刻 5 min时刻,装约20 mL淀粉溶液，标记，转至37水浴锅中,因淀粉中含有少量还原糖，某些溶液有色素、杂质，需查看酶不水解淀粉的情况,37 ,室温,六.结果处理,1、分别计算0时刻、5 min时刻的A,540nm,平均值。,2、根据图表中的实验结果，并利用实验 “3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准曲线，计算淀粉酶的活力。,需要详细过程。,5 min时刻吸光值,0 min时刻吸光值,5 min时刻还原糖mg数,0 min时刻还原糖mg数,二者相减，计算酶活力。,1 U=1 mg 还原糖/min,mL 酶*稀释倍数,七. 思考题,1、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？,2、本实验中,两次,加入NaOH溶液的,意义,是什么,?,八、分析,1.三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？,2.酶液的稀释倍数是否要改变。,3.计算酶液的总活力、回收率。,