常用分子生物学技术的原理及其应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,目录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学与分子生物学,常用分子生物学技术的原理及应用,The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology,第二十章,第一节,分子杂交与印迹技术,Molecular Hybridization and Blotting Technique,核酸分子杂交,(nucleic acid hybridization),在,DNA,复性过程中，如果把不同,DNA,单链分子放在同一溶液中，或把,DNA,与,RNA,放在一起，只要在,DNA,或,RNA,的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链,(,heteroduplex,),。,一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,RNA,DNA,（一）印迹技术,利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到,NC,等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“,blotting,”,，译为印迹技术。,用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“,探针,”，探针可以与固定在,NC,膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,（二）探针技术,二、印迹技术的类别及应用,（一）,DNA,印迹,(Southern blotting),（二）,RNA,印迹,(Northern blotting),（三）蛋白质的印迹,(Western blotting),用于基因组,DNA,、重组质粒和噬菌体的分析。,用于,RNA,的定性定量分析。,用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,其他：,斑点印迹,(dot blotting),原位杂交,(in situ hybridization),DNA,点阵,(DNA array),DNA,芯片技术,(DNA chip),三种印迹技术的比较,分子杂交实验,放射自显影照片,DNA,芯片技术,第二节,PCR,技术的原理与应用,The Principle and Application of,PCR Technology,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,一、,PCR,技术的工作原理,5,5,5,5,5,5,5,5,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,25,30,次循环后，模板,DNA,的含量可以扩大,100,万倍以上。,PCR,技术原理示意图,PCR,的基本反应步骤,变性,95C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,模板,DNA,特异性引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,PCR,体系基本组成成分,利用特异性引物以,cDNA,或基因组,DNA,为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的,mRNA,为模板获得目的片段；,利用简并引物从,cDNA,文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；,利用随机引物从,cDNA,文库或基因组文库中克隆基因。,二、,PCR,技术,的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用,PCR,技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR,技术高度敏感，对模板,DNA,的量要求很低，是,DNA,和,RNA,微量分析的最好方法。,（三）,DNA,和,RNA,的微量分析,（二）基因突变,将,PCR,技术引入,DNA,序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；,待测,DNA,片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。,PCR,与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,（四）,DNA,序列测定,（五）基因突变分析,逆转录,PCR(reverse transcription PCR,，,RT-PCR),是将,RNA,的逆转录反应和,PCR,反应联合应用的一种技术。,RT-PCR,是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的,RNA,进行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆转录,PCR,技术,三、几种重要的,PCR,衍生技术,原位,PCR(in situ PCR),是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的,PCR,反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测,DNA,或,RNA,是否在该组织或细胞中存在。,原位,PCR,方法弥补了,PCR,技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。,（二）原位,PCR,技术,（三）实时,PCR,技术,实时,PCR(real-time PCR),技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量,PCR,。,实时,PCR,技术原理,Q,R,3,3,5,5,上游引物,下游引物,荧光标记引物,R,Q,3,3,5,5,实时,PCR,分类：,实时,P,R,C,非探针类,探针类,1.TaqMan,探针法,2.,分子信标探针法,3.FRET,探针法,图,20-3 TaqMan,探针法实时,PCR,原理示意图,第三节,基因文库,Gene Library,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),cDNA,文库,(cDNA library),基因文库,(,gene library),是指一个包含了某一生物体全部,DNA,序列的克隆群体。,一、基因组,DNA,文库,基因组,DNA,文库是指生物的,基因组,DNA,的信息（包括所有的编码区和非编码区）以,DNA,片段形式贮存的克隆群体。,用于构建基因组文库的载体有,噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。,基因组文库和,cDNA,文库的构建和筛选,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,cDNA,文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部,mRNA,经逆转录而合成的,cDNA,序列,的克隆群体，它以,cDNA,片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。,二、,cDNA,文库,第四节,生物芯片技术,Biological Chip Technique,是指将许多特定的,DNA,片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作,DNA,微阵列,(DNA microarray),。,一、基因芯片,基因芯片,(gene chip),基因芯片工作流程示意图,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质分子间的亲和反应,蛋白质芯片,(protein chip),蛋白质芯片,作用原理,第五节,生物大分子相互作用研究技术,The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白质相互作用研究技术,酵母双杂交,各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）,荧光共振能量转换效应分析,噬菌体显示系统筛选,常用蛋白质相互作用的研究技术,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,（一）标签蛋白沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,标签融合蛋白沉淀实验流程示意图,（二）酵母双杂交技术的基本原理,和用途,酵母双杂交系统的应用,证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。,分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。,将拟研究的蛋白质的编码基因与,BD,基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选,AD,基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。,电泳迁移率变动测定,(,electrophoretic mobility shift assay,，,EMSA),或称凝胶迁移变动实验,(,gel shift assay),最初用于研究,DNA,结合蛋白与相应,DNA,序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究,RNA,结合蛋白和特定,RNA,序列间的相互作用。,二、,DNA-,蛋白质相互作用分子分析技术,（一）电泳迁移率变动测定,放射自显影,未结合探针,结合有蛋白的探针,标记探针,1X,1X,1X,1X,核蛋白提取物,1X,10X,10X,未标记探针,10X,凝胶迁移实验结果示意图,染色质免疫沉淀技术,(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP,),是目前可以研究体内,DNA,与蛋白质相互作用的主要方法。,（二）染色质免疫沉淀法,染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图,