HXY-第四章-目的基因的获取

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四章,目的基因的获取,目的基因：,准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,基因克隆的本质是把某一目的,DNA,片段通过无性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。,一般而言，基因克隆包括四部分工作：,1,、目标,DNA,片段的获得；,2,、克隆载体的构建；,3,、寄主细胞的转化；,4,、重组体克隆的选择和鉴定,。,目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。,大肠杆菌作为寄主进行,DNA,克隆的实验方案,DNA,片段,的获得,载体构建,细菌转化,重组体,的鉴定,限制性内,切酶消化,机械切割,双链,c,DNA,的合成,化学法,直接合成,同聚物,加尾,粘性末端,连接,平末端,连接,加接头造成,粘性末端,重组噬菌体,DNA,转染,重组质粒,的转化,体外包装,进行转导,表型鉴定,核酸杂交,免疫学分析,酶切鉴定,第一节,基因组,DNA,片断化,一、限制性内切酶法,用限制性内切酶把基因组,DNA,切成不同大小的片断。,酶切,由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。,1.,优点,2.,缺点,目的基因,内部,也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！,BamH I,BamH I,BamH I,gene,二、随机片断化,1.,限制性内切酶局部消化法,控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。,内切酶识别位点的碱基数,影响所切出的产物的长度和随机程度。,（,1,）限制性内切酶的选用原则,1,）,4bp,的内切酶,平均每,4,6,（,4096,）,bp,一个切点。,2,）,6bp,的内切酶,平均每,4,4,（,256,）,bp,一个切点。,随机程度高。如,Hae,、,AluI,、,Sau3A,。,内切酶粘性末端,能与常用克隆位点相连。,（,Sau3ABamH I,）,2.,机械切割法,（,1,）超声波,超声波强烈作用于,DNA,，可使其断裂成约,300bp,的随机片断。,（,2,）高速搅拌,1500,转,/,分下搅拌,30min,，可产生约,8kb,的随机片断。,1976,年,H.G. Khorana,提出了用化学方法合成基因的设想，并于,1979,年在,science,上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸,tRNA,基因的论文。,第二节,化学合成目的基因,一、目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法,自动化合成法。,保护,dNTP,的,5,端,P,或,3,端,-OH,用酸或碱脱保护,（,1,）原理,1.,磷酸二酯法,带保护的单核苷酸连接,保证合成反应的定向进行。,带,5,保护的单核苷酸与带,3,保护的另一个单核苷酸以,磷酸二酯键,连接起来。,原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在,3,端磷酸和,5-OH,上都先连接了一个保护基团。,2.,磷酸三酯法,将第一个核苷酸的,3-OH,端固定在,固相支持物上。,固相磷酸三酯合成法,是目前通用的合成方法。,15,合成的二核苷酸连接处有三个酯键！,固相磷酸三酯合成,过程,固相支持物,结果是全保护的,DNA,：,5 DMT, 3,固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护,固相,支持物,固相,支持物,C,化学合成的,DNA,片断一般在,200bp,以内。,二、,化学合成,DNA,片断的组装,用,T4,多核苷酸激酶,使各个片段的,5,端带上磷酸。,1.,互补连接法,预先设计合成的片断之间都有,互补区域,，不同片断之间的互补区域能形成有,断点,的完整双链。,（,2,）,5,端磷酸化,（,1,）互补配对,（合成的,DNA,单链的,5,端是,-OH,）,T4 DNA,连接酶,T4,多核苷酸激酶,使,5-OH,磷酸化,完整的,DNA,双链,（,3,）,连接酶连成完整双链,2.,互补延伸连接法,预先设计的片断之间有,局部互补区,，可以相互作为另一个片断延长的引物，用,DNA,聚合酶,延伸成完整的双链。,3,5,5,3,5,3,T4DNA,连接酶,Klenow,片段,引物,1.,直接合成基因,三、,寡聚核苷酸化学合成的优点,2.,合成引物（,20mer,左右）,（,1,）,mRNA,的含量很低，很难作,cDNA,3.,合成探针序列,4.,定点突变合成,合成带有,定点突变,的基因片断。,（,2,）有些基因比较短，化学合成费用较低,DNA,合成仪,5.,合成人工接头或衔接物,含有各种酶切位点,人工接头,（,Adaptor,）或,衔接物,（,Linker,）序列。,EcoRI,EcoRI,Linker,Adaptor,将某种生物细胞的,整个基因组,DNA,切割成大小合适的片断，并将,所有这些片断,都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中,保存和扩增,。,理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的,全部基因,，称为基因文库。,一、基因文库的构建,1.,基因文库（,gene library,）,第三节,目的基因的保存和扩增,（,2,）,目前常用的载体,2.,构建基因文库的载体选用,载体能够容载的,DNA,片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的,重组子,的数目。,载体容量越大，所要求的,DNA,片断数目越少，所需的,重组子,越少。,（,1,）对载体的要求,载体系列：,容量为,24 kp,cosmid,载体：,容量为,50 kb,YAC,：,容量为,1 Mb,BAC:,容量为,300 kb,断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。,（,1,）染色体,DNA,大片段的制备,3.,基因文库构建的一般步骤,超声波（,300bp,）或机械搅拌（,8kb,）。,物理切割法：,内切酶,Sau3A,进行局部消化。可得到,10-30kb,的随机片断。,酶切法：,（,2,）载体与基因组,DNA,大片段的连接,粘性末端直接连接,载体与外源,DNA,大片段的两个末端都有相同的粘性末端。,如：,Sau3A,与,BamHI,的酶切末端。,直接连接、人工接头或同聚物加尾。,人工接头法（,adaptor,）,人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。,各种酶的接头可以向公司定做或购买。,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,粘性末端,同聚物加尾,4.,基因组文库的大小,一个文库要包含,99%,的基因组,DNA,时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-p),ln (1-f),p:,文库包含了整个基因组,DNA,的概率（,99%,）,f:,插入载体的,DNA,片断的平均长度占整个基因,组,DNA,的,百分数,N,：所需的重组载体数（克隆数）,例如：人的基因组是,3,10,9,bp,，插入,DNA,片断的平均长度如果是,1.7,10,4,bp,N=,ln (1-p),ln (1-f),=,ln (1-99%),ln (1-f),=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G,：,G,enome,大小；,f,：,f,ragment,大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,3,10,9,1.710,4,=,8.1,10,5,1. cDNA,以,mRNA,为模板,逆转录,出的,DNA,称,cDNA,。,2. cDNA library,二、,cDNA,文库的构建,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的,总,mRNA,合成,cDNA,，再将这些,cDNA,与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称,cDNA,文库。,（,1,）,不含内含子序列,。,（,2,）可以在细菌中直接表达。,（,3,）包含了所有,编码蛋白质的基因,。,（,4,）比,DNA,文库小,的多，容易构建。,4.,构建,cDNA,文库的一般步骤,（,1,）总,RNA,（,total RNA,）提取,3. cDNA,文库的特点,提取总,RNA,有商业化的试剂盒（,kit,）。,分离,mRNA,用商业化的,Oligo dT,纤维柱。,利用,mRNA,都含有一段,polyA,尾巴，将,mRNA,从总,RNA,（,rRNA,、,tRNA,等）中分离纯化。,mRNA,只占总,RNA,的,1%-2%,。,（,2,）,mRNA,的分离纯化,原理,mRNA,的分离纯化,Column,（柱）,反转录酶,（,3,）,cDNA,的合成,cDNA,第一链合成,逆转录酶能以,RNA,为模板合成,DNA,。,用,Oligo dT,（或随机引物）作引物，合成,cDNA,的第一链。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT,引物,用,碱,处理或用,RNaseH,降解,mRNA-DNA,杂交分子中的,mRNA,。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,3,5,5,引物,cDNA,第一链,3,5,引物,降解,mRNA,模板,或,RNaseH,碱,方法一：剩下的,cDNA,单链的,3,末端一般形成一个,弯回来的双链发卡结构,（机理不明），可成为合成第二条,cDNA,链的引物。用,DNA,聚合酶合成第二链,DNA.,。,cDNA,第一链,5,cDNA,第二链合成,DNA,聚合酶,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,cDNA,第二链合成,这种酶能识别,mRNA-cDNA,杂交分子中的,mRNA,，并将其降解成许多小,片断,。,方法二：妙用,RNaseH,小片断正好成为,DNA,聚合酶的引物，用来合成,冈崎片断,。,DNA Pol I,除去引物并修补后再使用,DNA,连接酶,连成一整条,DNA,链。,mRNA,cDNA,3,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,5,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,cDNA,第二链,cDNA,第一链,3,5,RNaseH,DNA ligase,去引物,去掉发卡结构,核酸酶,S1,用,核酸酶,S1,可以切掉发卡结构（但这会导致,cDNA,中有用的序列被切掉！）。,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,5,3,在双链,cDNA,末端接上,人工接头,，即可与载体连接，转入受体菌。,或借助,末端转移酶,给载体和双链,cDNA,的,3,端分别加上几个,C,或,G,，成为粘性末端。,5.,cDNA,与载体连接：,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,6. cDNA,文库的大小,一个,cDNA,文库要包含,99%,的,mRNA,时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-p),ln (1- ),p:,文库包含了完整,mRNA,的概率（,99%,）,:,某一种低丰度（不足,14,份拷贝）,mRNA,占细胞整个,mRNA,的比例,N,：所需的重组载体数（克隆数）,1,n,1,n,三、文库的查询（,screening,）,用目的基因探针与文库中的重组载体进行,Southern blot,杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,测序分析,第四节,目的基因的分离和扩增,一、目的基因的分离,1.,探针柱分离特异,mRNA,根据已知的基因序列合成探针，结合到,纤维素柱,上，用来分离纯化该基因的,mRNA,。,富集,特定基因的,mRNA,或,cDNA,模板。,纤,维,柱,探针,DNA,探针,DNA,探针,DNA,探针,DNA,Total mRNA,纤,维,柱,探针,DNA,探针,DNA,探针,DNA,探针,DNA,过柱,与探针碱基互补的,mRNA,结合到柱上，其它,mRNA,流走。,特异,mRNA,洗脱,RT-PCR,2. mRNA,消解杂交,原理：,羟基磷灰石柱,结合单链,DNA-RNA,或,DNA-DNA,双链，不结合单链,DNA,。,（,Hydroxylapatite column,）,从表达,A,蛋白,和不表达,A,蛋白的组织细胞中分别提取和分离,总,mRNA,。,将表达,A,蛋白的,mRNA,合成,cDNA,第一链。再同不表达,A,蛋白的总,mRNA,杂交成,cDNA-mRNA,双链。,不能杂交的,cDNA,就包括特异表达的,A,基因,的,cDNA,单链。,用,羟磷灰石柱,收集单链,cDNA,，合成为双链,DNA,进行扩增、克隆、测序。,A,A,A,组织,B,组织,总,mRNA,（,A,）,总,mRNA,（,B,）,含蛋白,A,的,mRNA,不含蛋白,A,的,mRNA,总,cDNA,第一链,A,杂交,内含蛋白,A,的,cDNA,羟磷灰石柱,过柱,吸收,RNA-DNA,单链滤过,羟磷灰石柱,B,A,PCR,16,cDNA,文库,3. mRNA,差异显示,PCR,（,DD RT-PCR,）,mRNA differential display RT-PCR,（,1,）,3,端的锚定引物,Oligo(dT),引物的,3,端加两个核苷酸（倒数第二个不再是,T,）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,M,：,A,、,G or C,N: A,、,G,、,T or C,5,3,（,2,）,12,种锚定引物,AG,TTTTTTTT,5,3,CG,TTTTTTTT,5,3,GG,TTTTTTTT,5,3,TG,TTTTTTTT,5,3,AA,TTTTTTTT,5,3,CA,TTTTTTTT,5,3,GA,TTTTTTTT,5,3,TA,TTTTTTTT,5,3,AC,TTTTTTTT,5,3,CC,TTTTTTTT,5,3,GC,TTTTTTTT,5,3,TC,TTTTTTTT,5,3,（,3,）,5,端的随即引物,10 mer,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,5,3,扩增,cDNA,第一链。,RT,NM,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA,第二链，并,PCR,（,4,）随机引物与锚定引物成对扩增,12,种锚定引物，若与,20,种随机引物，可组成,240,组引物。,引物组合：,240,组能分出,20000,多条带！,实验结果：,如果每条带相当于一种,mRNA,，,20000 mRNA,基本上反映了一种特定细胞中全部的,mRNA,。,在测序胶上，每组扩出,50-100,条长度为,100-500bp,的带。,（,5,）随机,-,锚定引物,PCR,的产物电泳比较,不同组织的,240,组引物组合,PCR,产物在测序胶中电泳。,选择有差异的带，进一步,PCR,作探针。,筛选文库，找到差别基因的全长序列。,二、,PCR,扩增获得目的基因,1.,直接从基因组中扩增,（,1,）提取基因组,DNA,作模板,（,2,）根据目的基因序列设计引物,（,3,）,PCR,扩增,真核生物基因组含有内含子！,适合扩增原核生物基因。,原核基因组部分,原核细胞,提取基因组,DNA,PCR,扩增,（,1,）提取基因组,total RNA,（,2,）反转录合成总,cDNA,作模板,（,4,）,PCR,扩增,（,3,）根据目的基因序列设计引物,2.,从,mRNA,中扩增,: RT-PCR,原核生物不易得到,mRNA,，也不含有,polyA,尾。,适合扩增真核生物基因。,目的基因,的引物,1,反转录成目的基因,cDNA,第一链,目的基因,的引物,2,目的,基因,cDNA,第二链,PCR,mRNA,克隆外源基因,