血清蛋白的醋酸薄膜电泳

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白,【实验目的】,1、,了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术；,2、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法。,实验六,【,实验原理,】,由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在,pH 8.6,的缓冲液中，各种血清蛋白质所带电荷量不同，同时由于它们的相对分子质量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在醋酸纤维薄膜上电泳后，可将各种血清蛋白质分离开。,血清中含有清蛋白，-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。,例如，以醋酸纤维素薄膜为,支持物，正常人血清在,PH8.6,的缓冲体系中电泳,1h,左右，染色后可显示,5,条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为,1,-,、,2,-,、,-,及,-,球蛋白（如图,3-5,）。,图,3-5,正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图,1,为清蛋白，,2,，,3,，,4,，,5,分别,1,-，,2,-，-及,-球蛋白，6为点样原点,这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。,此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。,【,实验材料,】,1,电泳仪 包括直流电源整流器和电泳槽两个部分。,2,醋酸纤维素薄膜。,试剂,4,试剂,巴比妥,-,巴比妥钠缓冲液,(pH8.6,0.07mol/L,离子强度,0.06),称取,1.66g,巴比妥（,AR,）和,12.76g,巴比妥钠（,AR,），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约,600mL,，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至,1000mL,。置,40C,保存，备用。,血清蛋白染色,染色液（,0.5%,氨基黑,10B,）：称取,0.5g,氨基黑,10B,，加蒸馏水,40mL,，甲醇（,AR,）,50mL,，冰乙酸（,AR,）,10mL,，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。,漂洗液：取,95%,乙醇（,AR,）,45mL,，冰乙酸（,AR,）,5mL,和蒸馏水,50mL,，混匀置具塞试剂瓶中贮存。,透明液：临用前配制。,甲液：取冰乙酸（,AR,）,15mL,，无水乙醇（,AR,）,85mL,，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。,乙液：取冰乙酸（,AR,）,25mL,，无水乙醇（,AR,）,75mL,，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。,保存液：液体石蜡。,定量洗脱液（,0.4mol/L NaOH,溶液）：,称取,16g,氢氧化钠（,AR,）用少量蒸馏水溶解后定容至,1000ml,。,【实验方法与步骤】,4 实验方法与步骤,仪器与薄膜的准备,1,、仪器与薄膜的准备,醋酸纤维素薄膜的润湿与选择,用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在,15-30s,内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。,将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约,30min,后，方可用于电泳。,电泳槽的准备,根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。,在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸,以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。,滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。,电极槽的平衡,用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡,15-20min,。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。,点样,2,、点样,取一张干净滤纸（,1010cm,），在距纸边,1.5cm,处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。,用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端,1.5cm,处。点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取,2-3L,血清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内，如图,3-6,所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。,此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。,图,3-6,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）,电泳,3,、电泳,用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上，如图,3-7,所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡,10min,。,用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为,0.3mA,（,8,片薄膜则为,4.8mA,）。通电,10-15min,后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为,0.5mA,（,8,片共,8mA,），电泳时间约,50-80min,。电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。,图,3-7,电泳装置剖视示意图,1.,纸桥,2.,电泳槽,3.,醋酸纤维素薄膜,4.,电泳槽膜支架,5.,电极室中央隔板,染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）,4,、染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）,用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含,0.5%,氨基黑,10B,染色液的培养皿中，浸染,5min,，取出后再用漂洗液浸洗脱色，每隔,10min,换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。,取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干。,图,3-8,血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱比较示意图,a.,蛋白染色,b.,脂蛋白染色,结果判断与定量,6,、结果判断与定量,一般血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示,5,条区带，其排列顺序见图,3-8a,，未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。,可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组分相对百分含量。,本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操作步骤：,取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4N氢氧化钠4ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色，波长用650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白A、1、2、球蛋白各管的光密度。,光密度总和TA+,1,2,各部分蛋白质的分数为：,A,（清蛋白）,%=A/T100,1,-,球蛋白,%=,1,/T100,2,-,球蛋白,%=,2,/T100,-,球蛋白,%=,/T100,-,球蛋白,%=,/T100,附：迁移率是胶体颗粒的一个物理常数，可用来鉴定蛋白质等物质以及研究它们的某些理化性质现将人血浆蛋白质的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考。,蛋白质名称,等电点,泳动脉,/(cm,2,V,-1,S,-1,),分子量,清蛋白,4.88,-5.910-5,69000,1-,球蛋白,5.06,-5.110-5,200000,2-,球蛋白,5.06,-4.110-5,300000,-,球蛋白,5.12,-2.810-5,9000-150000,-,球蛋白,6.85-7.50,-1.010-5,156000-300000,纤维蛋白元,5.40,-3.110-5,正常值：白蛋白,57,72%,1,球蛋白,2,5,2,球蛋白,4,9,球蛋白,6.5,12,球蛋白,12,20,表,3-12,人血浆蛋白质的等电及迁移率,备注,备注：,醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白的正常结果不同于纸上电泳，主要是白蛋白偏高，个别正常人白蛋白仅超过,70,。,-,，,-,，和,，,都偏低，个别正常人,球蛋臼可低到,12,左右。上述正常值仅供参考。,经电泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：,95,乙醇（,2:8,）溶液中,20,分钟，取出后将薄膜平贴于玻璃板上。干燥过程中，薄膜渐变透明。此透明薄膜可用扫描光密度计绘出电泳曲线，并可根据曲线的面积计算各组分的百分数。目前国内已有自动定量的光密度计生产。此透明薄膜可长期保存，供教学示教用。,【,注意事项,】,5,注意事项,醋酸纤维素薄膜的预处理,醋酸纤维素薄膜的预处理,薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮,15-30s,时，膜片吸水不均匀，则有白色斑点或条纹，这提示膜片厚薄不均，应弃去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。,点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹污染，取膜时，应戴指套或用夹子。,缓冲液的选择,缓冲液的选择,醋酸纤维素薄膜电泳常选用,pH8.6,巴比妥缓冲液，其浓度为,。选择何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。在选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为,8-10cm,，则需电压,25V/cm,膜长，电流强度为,膜宽。,当电泳时达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。,加样量,加样量,加样品量的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。,如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品,10.-5L,，相当于,5-1000g,的蛋白，血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过,1L,，相当于,6080g,的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。,点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。,电量的选择,电量的选择,电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为,宽膜为宜。,电流强度高，则热效应高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。,染色液的选择,染色液的选择,对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素薄膜溶解。,应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间太短，着色浅不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。,透明及保存,透明及保存,透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发而影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。,透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液体石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易展平。,【,实验方法,】,1,准备与点样,(1),将薄膜切成,2.5 cm8 cm,的小片。在薄膜无光泽面,(,正面,),的一端约,2 cm,处用硬铅笔划一点样线。,(2),将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲中，使膜条自然浸湿。,(3),将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条置洁净滤纸上。,(4),用载玻片点样。,2,电泳,将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面,