流式细胞仪分析技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞仪分析技术,流式细胞术,(flow,cytometry, FCM),是,20,世纪,70,年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、,DNA,、,RNA,、蛋白质、抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。,概述,流式细胞术（,FCM,）借鉴了荧光显微镜技术,同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展,将荧光显微镜的激发光源改为激光,使之具有更好的单色性与激发效率,因而大大提高了检测灵敏度,同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液,用计算机进行数据处理,从而大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数,被誉为是细胞分析领域的“,CT”,。,流式细胞术（,FCM,）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。,第一部分 流式细胞仪的分析及分选原理,第二部分,数据的显示与分析,第三部分 流式细胞仪免疫分析的技术要求,第四部分 流式细胞术在免疫学检查中的应用,第五部分 应用举例,流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、,射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。,第一部分 流式细胞仪的分析,及分选原理,该仪器具有高度的精密性，测定的数据准确可靠。既可分析单个细胞，也能区分群体细胞，检测的速度可达,5000,个细胞,/,秒，分选纯度可高达,99%,以上。,由于该仪器的多参数性、准确性、快速性及分选的高纯度性等特点，所以在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、病理学及临床医学等领域中得到越来越广泛的应用。,细胞组成,细胞功能,大小,细胞表面,/,胞浆,/,核,-,特异性抗原,粒度,细胞活性,DNA, RNA,含量,胞内细胞因子,蛋白质含量,激素结合位点,钙离子, PH,值,膜电位,酶活性,流式细胞仪常检测的细胞特性,经荧光色素染色的细胞或包裹在鞘液里的其他生物微粒，从,50,100,m,的喷嘴逐个高速喷出，通过一个聚焦的光源，进而通过各种光敏元件测量这些细胞或微粒所发射的散射光以及荧光，经计算机分析和处理可得到多种信息参数。,一、工作原理,结构示意图,单细胞液柱,已标记的单细胞悬液和鞘液,硅化管,流动室,喷嘴,荧光检测系统和,散射光感受系统,收集光信号,荧光染料被激发发光,光电倍增管,脉冲信号,计算机系统分析结果,放大,垂直相交,形成稳态,水平激光与之,基本过程,（,1,） 液流系统,（,2,） 光学系统,（,3,） 数据处理系统,1.,流式细胞仪的基本结构：,由样本和鞘液组成,待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流,鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。,（,1,）液流系统,喷嘴,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,鞘液,液流系统示意图,FCM,的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,激光光源：气冷式氩离子激光器,分色反光镜：反射长,/,短波长，通过短,/,长波长,光束成形器：两十字交叉放置的透镜,透镜组：形成平行光，除去室内光,滤片：长通、短通、带通,光电倍增管：,FS, SS,（散射光），,FL1, FL2, FL3, FL4,（荧光）,（,2,）光学系统,Flow,Tip,Laser,SS and FL,Detector,FS Detector,光学系统示意图,主要由计算机及其软件组成,（,3,）数据处理系统,细胞在液柱中与激光束相交时向周围,360,立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为,前向散射光,和,侧向散射光,。,二、散射光的测定,前向散射光,（,forward scatter,FS,）,：,激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度,(0.5,10,),向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比,。,FALS Sensor,Laser,前向散射光示意图,侧向散射光（,side scatter, SS,）：,激光束照射细胞时，光以,90,角散射的讯号，用于检测细胞,内部结构属性。,FALS Sensor,90,LS Sensor,Laser,侧向散射光,示意图,测得的,FS,与,SS,信号通过计算机处理，可得到,FS-SS,图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。,此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：,从非均一群体中鉴别出某些亚群,荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。,每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。,选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。,线性放大器和对数放大器,三、荧光测量,荧光染料的特性,激发波长,(EXCITING),发射波长,(EMISSION),荧光补偿,通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。,四、细胞分选原理,细胞悬液形成液流柱,流动室振动,液流断裂成液滴,空白液滴,含细胞的液滴,弃去,偏转落入收集器,压电晶体,产生,机械振动,不充电,充电,（一）分选基本原理,分选速度：,单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。,分选纯度：,分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。,分选收获率：,实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。,分选得率：,从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。,（二）分选的技术要求,参数：,FS,SS,FL,数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ）,设门分析技术,第二部分 数据的显示与分析,FS,：反映颗粒的大小,SS,：反映颗粒的内部结构复杂程度,FL,：反映颗粒被染上的荧光数量多少,一、 参数,单参数直方图,双参数直方图,:,点图,二维等高图,假三维等高图,三参数直方图,多参数分析,直分析方图,设门分析,:,REGION,和,GATE,设置,二、数据显示方式,由一维参数,(,散射光或荧光,),与颗粒计数,(COUNT),构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数直方图,单参数直方图,细胞相对数量,信道,(channel,),双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。,双参数信号,通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（二）双参数直方图,1.,双参数直方图点图,绿色荧光强度,红色荧光强度,双参数直方图点图,2.,二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。,等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即,“,等高,”,。,曲线层次越高,(,越里面的线,),所代表的细胞数愈多。,等高线越密集则表示细胞数变化率越大。,二维等高图,3.,假三维等高图,（三）三参数直方图,多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,（四）流式细胞仪的多参数分析,Gate,设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析技术,A,淋巴细胞,B,单核细胞,C,中性粒细胞,A,、,B,、,C,均为任意门,线性门,Region,设置,:,区阈（,region, R,）与门,(gate, G ),是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。,D1,CD4+/CD3-,D2,CD4+/CD3+,D3,CD4- /CD3-,D4,CD4- /CD3+,如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即,G=D1+D2+D3+D4,。,样本制备,标记染色,液相芯片技术,质量控制,第三部分 流式细胞仪免疫分析的技术要求,外周血淋巴细胞样品的制备,分离单个核细胞,培养细胞的样品制备,蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤,单细胞悬液,一、免疫检测样品制备,新鲜实体组织单细胞悬液的制备,机械法,酶处理法,化学试剂处理法,表面活性剂处理法,单细胞悬液的保存,深低温保存法（一年）,乙醇或甲醇保存法（,2,周）,甲醛或多聚甲醛保存法（,2,月）,适用条件,:,有较高的量子产额和消光系数,对,488nm,的激发光波长有较强的吸收,发射光波长与激发光波长间有较大的波长差,易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性,二、常用的荧光染料与标记染色,FITC,Texas red,PE.PC.APC,PEcy5,FL1,FL2,FL3,FL4,激光,细胞悬液,异硫氰酸荧光素,得州红,能量传递复合染料,藻胆蛋白类,（一）几种常见的荧光染料,名称,染料,激发波长,荧光颜色,溶解性,对,PH,敏感性,特点,异硫氰酸荧光素,FITC,488,绿,525,易,敏感,易溶于水，与抗体结合不影响特异性,得州红,Texas red,568,红,615,不易,不敏感,稳定，偶联后量子产额低,藻红蛋白,PE,488,橙,575,易,不敏感,具较多发光基团，消光系数和量子产额高,藻青蛋白,PC,488,别藻青蛋白,APC,633,红,670,能量传递复合染料,PEcy5,488,红,670,易,不敏感,减少交叉，成本高,常用的几类荧光染料,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在,488nm,激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。,能量传递复合染料,PE,CY5,CY5,CY5,488nm,575nm,670nm,红色荧光,花青苷,5,藻红蛋白,能量传递复合染料机制,荧光染料与细胞成分的四种结合方式,结构亲和式,嵌入结合,共价键结合,荧光标记抗体特异性结合,免疫荧光标记方法,直标,:,干扰少,但需购买多种单抗,间标,:,步骤多,干扰多,不需标记多种抗体,组合标记,（二）免疫荧光标记,免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术,是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待测标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测物产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“,液相芯片,”之称 。,三、免疫胶乳颗粒技术的应用,微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）,通过对标记不同荧光素分子的检测，实现,FCM,对可溶性物质的定量分析,适当的制备方式,处理红细胞,实体组织来源标本用机械法,温度,25,37,，,pH7.0,7.2,四、流式细胞免疫学技术的质量控制,（一）单细胞悬液制备的质控,温度,pH,染料浓度,固定剂,（二）免疫荧光染色的质控,光路与流路校正,:,确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（,CV,）。,PMT,（光电倍增管）校准,:,保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。,绝对计数校准,:,保证计数的准确性。,Flow-check,Flow-set,Flow-count,（三）仪器操作的质控,同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的,未标记单抗,作为对照调整和设置电压，以保证特异性。,全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。,（四）免疫检测的质控,流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。,第四部分 流式细胞术在免疫学检验中的应用,T,淋巴细胞及其亚群分析,Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T),B,淋巴细胞及其亚群分析,B1(CD19+CD5+):,产生,IgM,型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关,B2(CD19+CD5-):,受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体,NK,细胞分析,NK(CD3-CD16+CD56+),一、淋巴细胞及其亚群的分析,细胞介导细胞毒性试验,(,死细胞与活细胞比例,),细胞内细胞因子测定,二、淋巴细胞功能分析,三、淋巴造血系统及白血病免疫分型,对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型,用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变,CD4+Th,细胞、,CD4+/CD8+,比例,MDR(+),表示对化疗药物耐药,四、肿瘤耐药基因分析,五、,AIDS,病检测中的应用,HLA-B27,可出现在,58%,97%,的强直性脊椎炎,(As),患者,六、自身免疫病相关,HLA,抗原分析,FCM,作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的,FCM,应用主要包括流式细胞术的交叉配型（,Flow,cytometry,cross-matching, FCXM,）和群体反应性抗体（,Panel reactive antibody, PRA,）检测。,七、移植免疫中的应用,小 结,流式细胞术（,FCM,）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。,FCM,分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。,同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。,对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证,FCM,分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。,以北京宝赛生生物技术有限公司生产的,Annexin-v-FITC,凋亡检测试剂盒为例，介绍一种,Annexin-v-FITC,和,PI,双标记流式细胞检测法。,第五部分、应用举例,膜联蛋白,V(Annexin,-V),一种分子量,为,35-36KD,的,Ca2+,依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（,phosphatidylserine, PS,）高亲和力特异性结合。,碘化丙啶（,propidium,iodide, PI),是一种核酸染料，将,Annexin,-V,与,PI,匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。,以荧光素,FITC,标记了的,Annexin,-V,作为荧光探针，利用流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。,一、概述,（,1,）,Annexin-v-FITC,凋亡检测试剂盒：包括,Annexin,V-FITC(20,g/ml),，结合缓冲液，碘化丙啶,(50,g/ml,），,4,保存。,（,2,）流式细胞仪,二、用品,（,1,）调整待测细胞的密度为,5,105,1,106,个,/ml,。,（,2,）取,1ml,细胞，,1000rpm 4,离心,10min,，弃上清液。,（,3,）加入,1ml,冷的,PBS,，轻轻震荡，使细胞悬浮。,（,4,）,1000rpm 4,离心,10min,，弃上清液。,（,5,）重复步骤,(3)(4),两次。,（,6,）对于贴壁细胞，先用,0.25%,胰蛋白酶消化，制成单个细胞悬液，再用,PBS,离心洗涤。,（,7,）将细胞重新悬浮于,200l,结合缓冲液。,（,8,）,加入,10lAnnexin V-FITC,和,50l,的,PI,，轻轻混匀，避光室温反应,15min,或,4,反应,30min,。,（,9,）加入,300l,结合缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测，光源为,488nm,氩离子激光器，,FITC,受激发后发绿色荧光，,PI,发红色荧光。,三、步骤,流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（,cytogram,），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数所在点的组分。,左下象限代表正常细胞（,An-PI-,），右下象限代表早期凋亡细胞（,An+PI,-),，右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（,An+PI,+,），左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（,An-PI+,）。,四、结果分析,