微生物基础知识在药品生产中的使用与延伸

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物基,础,础知识在,药,药品生产,中,中的使用,与,与延伸,内 容,微生物基,础,础知识简,介,介,热力灭菌,基,基本原理,紫外灯及,臭,臭氧灭菌,原,原理和要,求,求,药典对最,终,终灭菌产,品,品的无菌,标,标准,注射剂常,见,见灭菌方,法,法,灭菌工艺,的,的验证,容器密封,可,可靠性验,证,证,菌种的保,藏,藏和使用,第一部分,微生物基,础,础知识简,介,介,微生物生,存,存的环境,人类生活,的,的环境充,斥,斥着大量,微,微生物,海拔,100英,里,里（约160公里,）,）以上,海平面以,下,下600,英,英尺（约182米,）,）的地方,都,都可以发,现,现微生物,的,的踪迹,1英里=5,280英尺或1.609公里,常见微生,物,物,种类,基本特点,细菌,0.5 5 m，生长态时不耐热，部分,能形成耐热芽孢,真菌,5 m 50 m，形成芽孢随空气扩,散，不耐热,病毒,小于,0.1 m，一般不耐热，0.22m,过滤不了,真菌和细,菌,菌,大小,真菌,5 m 50 m,细菌,0.5 5 m,主要成员,酵母、霉菌,细菌,细胞组成,酵母是单细胞，其它为多细胞,均为单细胞,细胞质,成份,遗传物质(DNA)被双层核膜包裹(真,核)，并且还有如线粒体、叶绿体及,高尔基体等被膜包裹的细胞器。,遗传物质(DNA)祼露并游离于细胞质,核区内(原核)。,繁殖方式,有性（如大型真菌或无性如酵母）,或二者兼有,无性（裂殖）,孢子,霉菌产生分生孢子（生长繁殖，类似,于植物的种子,)，虽不耐热，但会飘,浮于空气中而难以消除。,酵母不会产生孢子。,主要只有两个属产生孢子（内生孢,子），又名芽孢：,Bacillus-芽孢杆菌属和,Clostridium-梭菌属 ，细菌芽孢属于,休眠体，一个细菌细胞产生一个芽孢,适宜生长条件,20-25,o,C,30-35,o,C,杀灭程度,不耐热，但难用消毒剂消毒（因孢子处于漂浮状态）,生长态菌不耐热（极个别除外），但,形成芽孢后耐热。,微生物分,布,布特点,微生物无,处,处不在,气源性微,生,生物革兰,氏,氏阳性菌,较,较多,它们可形,成,成芽孢，,难,难以杀灭,因此，药,品,品生产需,要,要,HVAC,水源性则,革,革兰氏阳,性,性菌居多,不会生成,孢,孢子,但会形成,细,细菌内毒,素,素,耐热性差,生长态菌,及,及孢子,将植物比,喻,喻微生物,，,，不恰当,而,而直观,如玉米，,发,发芽,生,生长,种,种子，前,二,二种相当,于,于微生物,的,的生长状,态,态，到了,种,种子，对,环,环境的（,水,水分、温,度,度等）耐,受,受性大大,增,增强,然而，微,生,生物的芽,孢,孢，并不,是,是繁殖的,手,手段，而,是,是休眠体,，,，植物没,有,有这种相,对,对应的东,西,西,革兰氏阳,性,性菌：气,源,源性,革兰氏阴,性,性菌：则,是,是水源性,的,的，细胞,结,结构不同,生物指示,剂,剂均为革,兰,兰氏阳性,菌,菌，灭菌,用,用,BI为非,致,致病菌。,细菌芽胞,（,（孢）的,形,形成及其,特,特性,内生孢子,产生于,Gram,+,细菌:,芽孢杆菌,属,属,Bacillus,梭菌属,Clostridium,仅含核酸,及,及少量萌,发,发必需物,皮层含,DPA和Ca,2+,复合物,能抵御各,种,种恶劣环,境,境,可休眠上,百,百万年,真菌孢子,因,因不具上,述,述特性,而不耐热,DPA：,吡,吡啶二羧,酸,酸,成熟芽孢,孢子壁,母细胞,孢子壁的形成,生长态细胞,生物指示,剂,剂（,BI）的,定,定义,对特定灭,菌,菌工艺具,有,有一定耐,受,受性并能,用,用于定量,测,测定灭菌,效,效力的微,生,生物制剂,（,USP28）,特点,用于制备,生,生物指示,剂,剂的微生,物,物应具有,相,相当的耐,受,受性、稳,定,定性、易,培,培养、及,非,非致病性,相用于被,验,验证产品,、,、灭菌工,艺,艺、生产,工,工艺,符合有关,法,法规的要,求,求,什么是芽,孢,孢？,当某些细,菌,菌遇到不,良,良生存环,境,境条件时,，,，为保护,自,自身，在,细,细胞内形,成,成一外壁,厚,厚而坚硬,的,的体眠体,，,，该体眠,体,体即称芽,孢,孢（,Spore）或孢,子,子。,由于其对,不,不良环境,的,的耐受性,远,远高于生,长,长态细胞,，,，常被用,于,于挑战灭,菌,菌工艺，,以,以确认被,灭,灭菌物品,无,无菌的可,靠,靠性。,芽孢的特,性,性,主,要,要,产,产,生,生,于,于,Gram,+,细,菌,菌,的,的,两,两,个,个,属,属,芽,孢,孢,杆,杆,菌,菌,属,属,Bacillus,梭,菌,菌,属,属,Clostridium,能,抵,抵,御,御,各,各,种,种,恶,恶,劣,劣,环,环,境,境,，,，,可,可,存,存,活,活,上,上,百,百,万,万,年,年,，,，,因,因,为,为,它,它,有,厚,厚,的,的,皮,皮,层,层,结,结,构,构,仅,含,含,核,核,酸,酸,及,及,少,少,量,量,萌,萌,发,发,必,必,需,需,物,物,含,水,水,量,量,极,极,低,低,休,眠,眠,体,体,，,，,内,内,生,生,孢,孢,子,子,，,，,不,不,可,可,再,再,生,生,（,（,每,每,个,个,细,细,胞,胞,只,只,产,产,生,生,一,一,个,个,芽,芽,孢,孢,）,）,；,；,真,真,菌,菌,孢,孢,子,子,属,属,于,于,分,分,生,生,孢,孢,子,子,，,，,不,不,具,具,上,上,述,述,特,特,性,性,。,。,芽,孢,孢,的,的,特,特,点,点,耐,热,热,80,下,下,长,长,期,期,存,存,活,活,100,下,下,有,有,相,相,当,当,高,高,的,的,存,存,活,活,率,率,100,以,以,上,上,死,死,亡,亡,过,过,程,程,符,符,合,合,一,一,级,级,动,动,力,力,学,学,方,方,程,程,影,响,响,芽,芽,孢,孢,耐,耐,热,热,性,性,的,的,因,因,素,素,芽,孢,孢,存,存,在,在,的,的,介,介,质,质,受,热,热,时,时,的,的,湿,湿,度,度,生,物,物,指,指,示,示,剂,剂,（,（,BI,）,）,对,特,特,定,定,灭,灭,菌,菌,工,工,艺,艺,具,具,有,有,一,一,定,定,耐,耐,受,受,性,性,并,并,能,能,用,用,于,于,定,定,量,量,测,测,定,定,灭,灭,菌,菌,效,效,力,力,的,的,微,微,生,生,物,物,制,制,剂,剂,（,USP28,）,）,特,点,点,芽,孢,孢,用,于,于,制,制,备,备,生,生,物,物,指,指,示,示,剂,剂,的,的,微,微,生,生,物,物,应,应,具,具,有,有,相,相,当,当,的,的,耐,耐,受,受,性,性,、,、,稳,稳,定,定,性,性,、,、,易,易,培,培,养,养,、,、,及,及,非,非,致,致,病,病,性,性,第,二,二,部,部,分,分,热,热,力,力,灭,灭,菌,菌,基,基,本,本,原,原,理,理,热,对,对,微,微,生,生,物,物,的,的,作,作,用,用,当,高,高,温,温,破,破,坏,坏,了,了,细,细,胞,胞,中,中,起,起,生,生,命,命,作,作,用,用,的,的,蛋,蛋,白,白,质,质,、,、,酶,酶,及,及,核,核,酸,酸,时,时,，,，,细,细,胞,胞,死,死,亡,亡,。,。,生,命,命,基,基,本,本,物,物,质,质,的,的,破,破,坏,坏,本,本,质,质,上,上,是,是,化,化,学,学,变,变,化,化,实,验,验,证,证,明,明,微,微,生,生,物,物,受,受,热,热,死,死,亡,亡,速,速,度,度,符,符,合,合,一,一,级,级,动,动,力,力,学,学,方,方,程,程,一,级,级,动,动,力,力,学,学,方,方,程,程,式,式,dN/dt,K(N,0,N,t,),N,0,为,t,0,时,时,，,，,存,存,活,活,的,的,微,微,生,生,物,物,数,数,；,；,N,t,为,t,时,时,被,被,杀,杀,灭,灭,的,的,微,微,生,生,物,物,数,数,；,；,N,为,为t,时,时,存,存,活,活,的,的,微,微,生,生,物,物,数,数,K,为,为,常,常,数,数,。,。,对,数,数,规,规,则,则,微,生,生,物,物,存,存,活,活,数,数,与,与,灭,灭,菌,菌,时,时,间,间,关,关,系,系,图,图,半,对,对,数,数,座,座,标,标,Y轴及X轴均为普通座标（示意）,t,N,10,20,30,10,100,1000,t,lgN,10,20,30,1,2,3,Y,轴,轴,：,：,微,微,生,生,物,物,取,取,对,对,数,数,X,轴,轴,：,：,时,时,间,间,为,为10,进,进,制,制,普,普,通,通,座,座,标,标,芽,孢,孢,的,的,耐,耐,热,热,参,参,数,数,：,：,D,值,值,指,一,一,定,定,温,温,度,度,下,下,将,将,微,微,生,生,物,物,杀,杀,灭,灭,90,或,或,下,下,降,降,一,一,个,个,对,对,数,数,单,单,位,位,所,所,需,需,要,要,的,的,时,时,间,间,。,。,lgN,t,1,2,3,4,t,1,t,2,D,灭,菌,菌,温,温,度,度,对,对,D,值,值,的,的,影,影,响,响,115,121,125,lgN,t,lgN=1,D,125,D,121,D,115,灭,菌,菌,温,温,度,度,低,低,时,时,，,，,达,达,到,到,同,同,一,一,灭,灭,菌,菌,效,效,果,果,的,的,时,时,间,间,就,就,长,长,F,0,值,：,：,达,达,到,到,同,同,一,一,灭,灭,菌,菌,效,效,果,果,的,的,概,概,念,念,F,0,值,即,即,标,标,准,准,灭,灭,菌,菌,时,时,间,间,指,产,产,品,品,在,在,灭,灭,菌,菌,过,过,程,程,中,中,获,获,得,得,的,的,与,与,标,标,准,准,参,参,照,照,条,条,件,件,（,（,121,）相,同,同灭菌,效,效果的,曝,曝热时,间,间,lgN,t,LgNo,LgNt,121,117,LgN,F,T,Fo,不同灭,菌,菌温度,下,下的灭,菌,菌率,灭菌温度,灭菌率,L,100,0.008,105,0.025,112,0.126,115,0.251,116,0.316,118,0.501,120,0.794,121,1.000,122,1.25,123,1.59,灭菌率,：,：为达,到,到与某,一,一温度,下,下灭菌,1分钟,相,相同的,灭,灭菌效,果,果，在121,下灭,菌,菌所需,要,要的灭,菌,菌时间,100,灭,灭菌,时,时1,分,分钟,，,，相,当,当于121,灭,菌,菌0.008,分,分钟,，,，即Fo,值,值为0.008分,钟,钟。,105,灭,灭菌40,分,分钟,时,时，Fo,约,约为1,分,分钟,，,，能,使,使D,值,值为1分,钟,钟的,芽,芽孢,数,数量,下,下降1个,对,对数,单,单位,第三,部,部分,紫,紫,外,外灯,及,及臭,氧,氧灭,菌,菌原,理,理和,要,要求,紫外,线,线的,分,分类,UVA波,段,段，,波,波长320400nm，,又,又称,为,为长,波,波黑,斑,斑效,应,应紫,外,外线,UVB波,段,段，,波,波长275320nm，,又,又称,为,为中,波,波红,斑,斑效,应,应紫,外,外线,UVC波,段,段，,波,波长100275nm，,又,又称,为,为短,波,波灭,菌,菌紫,外,外线,UVD波,段,段，,波,波长,小,小于100nm，,又,又称,为,为真,空,空紫,外,外线,破坏,及,及改,变,变微,生,生物,的,的DNA,（,（脱,氧,氧核,糖,糖核,酸,酸）,结,结构,，,，使,细,细菌,当,当即,死,死亡,或,或不,能,能繁,殖,殖后,代,代。,每一,种,种微,生,生物,都,都有,其,其特,定,定紫,外,外线,杀,杀灭,、,、死,亡,亡剂,量,量标,准,准。,紫外,线,线的,杀,杀菌,原,原理,紫外,线,线灭,菌,菌要,求,求,杀灭,一,一般,细,细菌,繁,繁殖,体,体应,达,达20000mw.s/cm,2,杀灭,细,细菌,芽,芽胞,应,应达,到,到100000mw.s/cm,2,杀灭,病,病毒,真,真菌,孢,孢子,应,应达,到,到600000mw.s/cm,2,适宜,条,条件,和,和范,围,围,紫外,线,线可,以,以杀,灭,灭各,种,种微,生,生物,，,，包,括,括细,菌,菌繁,殖,殖体,、,、芽,孢,孢、,分,分枝,杆,杆菌,、,、病,毒,毒、,真,真菌,、,、立,克,克次,体,体和,支,支原,体,体等,紫外,线,线仅,能,能杀,灭,灭直,接,接照,射,射到,的,的微,生,生物,紫外,线,线消,毒,毒纸,张,张、,织,织物,等,等粗,糙,糙表,面,面时,，,，要,适,适当,延,延长,照,照射,时,时间,，,，且,两,两面,均,均应,受,受到,照,照射,。,。,紫外,线,线消,毒,毒的,适,适宜,温,温度,范,范围,是,是20,40,相,相对,湿,湿度,低,低于,8,0%,紫外,线,线杀,灭,灭被,有,有机,物,物保,护,护的,微,微生,物,物时,，,，应,加,加大,照,照射,剂,剂量,臭氧,灭,灭菌,原,原理,作用,细,细胞,壁,壁和,细,细胞,膜,膜，,在,在脂,质,质（,类,类脂,化,化事,合,合物,）,）形,成,成双,键,键,破坏,细,细胞,膜,膜，,并,并使SH,酵,酵素,被,被破,坏,坏,臭氧,灭,灭菌,要,要求,杀灭,芽,芽孢,杆,杆菌,属,属的,细,细菌,孢,孢子,和,和酵,母,母，,需,需要,较,较长,时,时间,杀灭,芽,芽孢,杆,杆菌,属,属的,细,细菌,孢,孢子,和,和酵,母,母，,浓,浓度,应,应达,到,到0.3-0.5mg/l,一般,性,性灭,菌,菌，,应,应大,于,于10ppm,第四,部,部分,药,药,典,典对,最,最终,灭,灭菌,产,产品,的,的无,菌,菌标,准,准,无菌,检,检查,的,的局,限,限性,历史,的,的教,训,训,：,1962,年,年，,美,美国FDA颁,布,布第,一,一部GMP,1970-1975年,，,，美,国,国输,液,液污,染,染至,败,败血,症,症400,多,多起,-,有,有问,题,题的,产,产品,全,全部,通,通过,了,了无,菌,菌检,查,查,无菌,检,检查,的,的风,险,险,取样量为,20瓶时污染率与通过无菌检查概率的关系,批产品污染率,5,10,15,20,通过无菌检查的概率,36,12,4,1,药典,对,对无,菌,菌保,证,证的,定,定量,标,标准,19,73,年,年的,英,英国,药,药典,和,和1980年USP增,补,补版,提,提到,了,了无,菌,菌的,量,量化,标,标准,Fo,不,不小,于,于8,分,分钟,经灭,菌,菌后,，,，产,品,品中,污,污染,菌,菌存,活,活的,概,概率,不,不大,于,于百,万,万分,之,之一,。,。,中国药典,在,在,2000,版,版起，收,载,载了此标,准,准。,无菌保证,值,值：污染,菌,菌存活概,率,率的负对,数,数，经灭,菌,菌后，产,品,品的无菌,保,保证值不,小,小于6,“,无菌,”,的标准及,概,概念,“,每批产品,中,中，污染,品,品概率不,得,得超过一,百,百万分之,一,一,”,，无菌的,这,这一量化,标,标准应当,可,可以用试,验,验来证明,的,的。,每瓶产品,微,微生物存,活,活的概率,却,却可计算,的,的。,这就需要,测,测试产品,灭,灭菌前微,生,生物污染,数,数、,D值，使,用,用对数规,则,则，并用,生,生物指示,剂,剂试验来,证,证实。,量化指标+ 计,算,算 +,试,试验，使,无,无菌标准,成,成为工业,界,界可执行,的,的标准,产品灭菌,完,完全的必,要,要措施,从公式,SAL, F,0,/D,lgN,0,看灭菌完,全,全的必要,措,措施,足够的,F,0,值,产品灭菌,前,前污染菌,检,检测,需氧菌总,计,计数（微,生,生物污染,水,水平）,污染菌耐,热,热性,产品灭菌,完,完全的必,要,要措施,-2,通常采用,的,的中间控,制,制手段：,对每批的,灌,灌封开始,和,和结束阶,段,段，分别,对,对灌装好,的,的半成品,取,取样检测,。,。,样品须作,需,需氧菌总,计,计数,将检品液,置,置于,100,下,下加热10分钟，,检,检查是否,有,有耐热芽,孢,孢存活,须对微生,物,物学检测,结,结果进行,趋,趋势分析,。,。,产品灭菌,完,完全的必,要,要措施,-3,FDA要,求,求,“,对于在灭,菌,菌前产品,污,污染菌检,测,测中所发,现,现的耐热,孢,孢子，必,须,须与验证,灭,灭菌工艺,所,所用生物,指,指示剂的,耐,耐热性进,行,行对比,”,产品灭菌,完,完全的必,要,要措施,-4,具体要求,：,：,如经热处,理,理后检出,的,的微生物,是,是芽孢类,微,微生物。,需,需将其培,养,养并收集,芽,芽孢，测,定,定其的耐,热,热性，将,之,之与验证,灭,灭菌工艺,用,用生物指,示,示剂的耐,热,热性进行,对,对比。,如果所分,离,离的污染,菌,菌耐热性,高,高于生物,指,指示剂的,耐,耐热性，,则,则必须使,用,用耐热性,更,更强的生,物,物指示剂,对,对灭菌工,艺,艺重新进,行,行验证,(,可以使用,生,生产中的,分,分离菌,),。,如果在生,产,产全过程,中,中，对微,生,生物污染,严,严格控制,，,，那么，,这,这种情况,发,发生的概,率,率是非常,小,小的。,无菌保证,水,水平举例,假定灭菌,开,开始时产,品,品中的污,染,染微生物,总,总数（,N,0,）为,100cfu/瓶,，,，污染微,生,生物的耐,热,热参数（D）为1,分,分钟，要,达,达到药典,规,规定的SAL不小,于,于6的标,准,准，灭菌F,0,值应达到,多,多少？相,当,当于,121,和115 下,灭,灭菌多少,分,分钟？,答：,F,0,=（SALlg,N,0,）,D =,（,（6+lg100）1= 8分,钟,钟，需在121,下,下灭菌8,分,分钟。,换算成115 ,下,下的灭菌,时,时间是：F,0,/L,115,=8/0.25=32分钟,。,。,无菌保证,水,水平举例,二,二,某复方氨,基,基酸注射,液,液采用,110,，,，30分,钟,钟的灭菌,程,程序，起,始,始污染微,生,生物仍为100cfu/瓶,，,，D值为0.5分,钟,钟，请计,算,算无菌保,证,证值和残,存,存微生物,污,污染的概,率,率。,答：其,SAL为,：,：SAL= F,0,/D -lgN,0,= L,110,t /D -lg100 =0.08,30/0.5-2 =2.8,残存微生,物,物的概率,为,为10,-2.8,0.158,通过无菌,检,检查的概,率,率为(1-0.158),20,=96.9%。,第五部分,注,注射剂,常,常见灭菌,方,方法,湿热灭菌,-1,湿热灭菌,通,通常指一,定,定压力下,的,的蒸汽灭,菌,菌，也包,括,括过热水,灭,灭菌（水,浴,浴式或喷,淋,淋式）,实际上只,要,要微生物,处,处于达到,水,水水蒸,气,气平衡状,态,态下的灭,菌,菌过程，,都,都是湿热,灭,灭菌,例：实验,室,室给微生,物,物取样瓶,灭,灭菌时通,常,常加入,1ml水,并,并密封。,水分的存,在,在有利于,灭,灭菌,湿热灭菌,特,特点,蒸汽有利,于,于蛋白质,的,的变性和,酶,酶的失活,，,，从而杀,灭,灭细胞,蒸汽热穿,透,透性强,灭菌效率,高,高,温度相对,较,较低,灭菌时间,相,相对短,灭菌过程,不,不产生任,何,何化学物,理,理污染,灭菌设备,控,控制参数,少,少，运行,稳,稳定，方,便,便管理,湿热灭菌,工,工艺之一,美国,FDA规,定,定的残存,概,概率法,灭菌过程,8 F,0,12,10,-6,热稳定性好的产品,以杀灭微生物作为实现无菌的手段,残存概,率法,Fo8,10,-6,热稳定性较差产品,工艺过程将防止产品被耐热菌污染放在首位，而不是仅依赖最终灭菌去消除污染,流通蒸,汽法,不计算,Fo,0.1%,热不稳定产品,加热是无菌生产工艺（除菌过滤）的补充手段,除菌,过滤法,LRV7,0.1%,不能加热的产品,LRV=log reduction value 过滤对数下降值，一般上游为10,7,下游为,1，则LRV=7,由于后续无菌操作较多，最终产品达到的无菌保证水平远低于除菌过滤的本身的能力,干热灭菌机,理,理,干热灭菌与湿热灭菌的动力学特,征,征相似，符,合,合“ 对,数,数规则”,，,，但灭菌的,机,机理却并不,相,相同。,干热灭菌为,何,何需较高的,温,温度？,水份的影响,：,：湿度低,机理不同：,干,干热灭菌是,使,使微生物氧,化,化而不是使,蛋,蛋白质变性,干热灭菌要,点,点,干热灭菌的,介,介质通常是,热,热空气,用对数规则,描,描述微生物,杀,杀灭过程，,准,准确性较差,温度高，,200 ,以,以上，有可,能,能到320,用于玻璃容,器,器、手术器,械,械等,无菌生产工,艺,艺中安瓿、,西,西林瓶的灭,菌,菌和去热源,干热灭菌与,去,去热原的关,系,系,去热原的工,艺,艺条件比孢,子,子杀灭程序,要,要苛刻得多,，,，通常相当,于,于标准干热,灭,灭菌时间,F,H,的数十倍。,如果干热法,去,去热原工艺,能,能使细菌内,毒,毒素下降,3个对数单,位,位，就不必,再,再进行微生,物,物的生物指,示,示剂挑战性,试,试验。,第六部分,灭,灭菌工艺的,验,验证,灭菌工艺的,验,验证,灭菌工艺验,证,证资料是国,外,外药品（注,射,射剂）注册,的,的必报材料,灭菌工艺条,件,件（灭菌介,质,质、温度时,间,间参数、装,载,载方式等）,灭菌设备和,灭,灭菌工艺的,验,验证（前者,与,与后者不同,）,）,灭菌工艺验,证,证资料包括,灭菌设备的,安,安装确认,灭菌设备的,运,运行确认,灭菌工艺的,验,验证,先对设备温,度,度仪表和验,证,证用仪表进,行,行校准,空载热分布,找到灭菌,过,过程中灭菌,设,设备的最冷,点,点,不同装载形,式,式、不同装,量,量规格产品,的,的热穿透试,验,验产品获,得,得的,F0,生物指示剂,验,验证-微生,物,物挑战性试,验,验,灭菌过程的,Fo 示意,热力灭菌常,用,用生物指示,剂,剂,灭菌方式,微生物（孢子）,D值范围（分）,湿 热121,嗜热脂肪芽孢杆菌,Bacillus stearothermophilus,1.5-3.0,枯草芽孢杆菌,Bacillus subtilis,0.3-0.7,凝结芽孢杆菌,Bacillus coagulans,0.4-0.8,梭状芽孢杆菌,Clostridium sporogenes,0.4-0.8,干热,150,枯草芽孢杆菌黑色变种,Bacillus subtilis var. niger,1.0,第七部分,容,容器密封,可,可靠性验证,产品存放期,密,密封可靠性,检,检查,-1,微生物侵入,试,试验,往产,品,品容,器,器内,灌,灌入,培,培养,基,基并,按,按常,规,规方,式,式压,塞,塞轧,盖,盖，,灭,灭菌,后,后冷,却,却备,用,用。,将冷,却,却后,的,的容,器,器倒,置,置，,并,并将,瓶,瓶口,完,完全,浸,浸没,于,于高,浓,浓度,的,的运,动,动性,细,细菌,溶,溶液,(如10,8,个菌,/ml),内,内，,如,如有,大,大肠,埃,埃希,氏,氏菌,、,、铜,绿,绿假,单,单胞,菌,菌或,粘,粘质,沙,沙雷,氏,氏菌,。,。,将容,器,器外,表,表面,消,消毒,并,并培,养,养，,看,看容,器,器内,是,是否,有,有挑,战,战性,细,细菌,生,生长,。,。,产品,存,存放,期,期密,封,封可,靠,靠性,检,检查,-2,此试,验,验条,件,件比,实,实际,储,储存,和,和运,输,输时,产,产品,遭,遭微,生,生物,污,污染,的,的条,件,件要,苛,苛刻,得,得多,。,。,另应,多,多留,一,一些,装,装有,培,培养,基,基产,品,品的,容,容器,，,，并,置,置于,与,与稳,定,定性,样,样品,相,相同,的,的贮,存,存条,件,件下,存,存放,。,。,每隔,一,一定,的,的时,间,间间,隔,隔（,如,如,12,，,，24，36,和,和48个,月,月等,）,），,取,取出,部,部分,容,容器,，,，按,上,上述,方,方法,进,进行,检,检测,，,，以,确,确定,密,密封,系,系统,的,的稳,定,定性,。,。,产品,存,存放,期,期密,封,封可,靠,靠性,检,检查,-3,应证,明,明产,品,品经,最,最长,灭,灭菌,时,时间,后,后，,容,容器,/胶,塞,塞系,统,统依,然,然保,持,持良,好,好的,密,密封,性,性。,如果,某,某产,品,品在,生,生产,过,过程,中,中不,止,止灭,菌,菌一,次,次，,那,那么,在,在密,封,封完,好,好性,验,验证,方,方案,中,中，,应,应取,灭,灭菌,程,程序,最,最长,时,时间,的,的样,品,品作,验,验证,试,试验,。,。,第八,部,部分,菌,菌种,的,的保,藏,藏和,使,使用,理想,的,的菌,种,种保,藏,藏方,法,法应,具,具备,的,的条,件,件,(1),经长,期,期保,藏,藏后,菌,菌种,存,存活,健,健在,；,；,(2),保证,高,高产,突,突变,株,株不,改,改变,表,表型,和,和基,因,因型,，,，特,别,别是,不,不改,变,变初,级,级代,谢,谢产,物,物和,次,次级,代,代谢,产,产物,生,生产,的,的高,产,产能,力,力。,(3),菌种,保,保藏,的,的基,本,本措,施,施是,低,低温,、,、干,燥,燥、,真,真空,。,。,基本,要,要求,：,：,在一,定,定时,间,间内,使,使菌,种,种不,死,死、,不,不变,基本,方,方法,：,：,生活,态,态,休眠,态,态,培养,基,基传,代,代培,养,养,寄主,传,传代,培,培养,冷冻,干燥,液氮,、,、低,温,温冰,箱,箱,沙土,管,管、,冷,冷冻,真,真空,干,干燥,菌种,保,保藏,方,方法,暂时,保,保藏,法,法,斜面,传,传代,法,法,穿刺,法,法,长期,保,保藏,法,法,液体,石,石蜡,法,法,甘油,管,管法,砂管,保,保藏,法,法,砂土,管,管保,藏,藏法,滤纸,片,片保,藏,藏法,冷冻,干,干燥,保,保藏,法,法,液氮,冷,冷冻,法,法,冷冻,保,保藏,种,种类,一、,普,普通,冷,冷冻,保,保藏,技,技术,(-20,),二、,超,超低,温,温冷,冻,冻保,藏,藏技,术,术,(-60,一,-80),三、,液,液氮,冷,冷冻,保,保藏,技,技术,普通,冷,冷冻,保,保藏,技,技术,(-20,),将液,体,体培,养,养物,或,或从,琼,琼脂,斜,斜面,培,培养,物,物收,获,获的,细,细胞,分,分接,到,到试,管,管或,指,指管,肉,肉，,然,然后,贮,贮藏,于,于一,冰,冰箱,的,的冷,藏,藏室,中,中，,或,或于,温,温度,范,范围,在,在,-5,-20,的普,通,通冰,箱,箱,(-20,),中。,或,或者,，,，将,菌,菌种,培,培养,在,在小,的,的试,管,管或,培,培养,瓶,瓶斜,面,面上,，,，待,生,生长,适,适度,后,后，,将,将试,管,管或,瓶,瓶口,用,用橡,胶,胶塞,严,严格,封,封好,，,，同,上,上置,于,于冰,箱,箱中,保,保存,。,。,用此,方,方法,可,可以,维,维持,若,若干,微,微生,物,物的,活,活力,1,2,年。,应注,意,意的,是,是经,过,过一,次,次解,冻,冻的,菌,菌株,培,培养,物,物不,宜,宜再,用,用来,保,保藏,。,。,保藏,过,过程,中,中应,注,注意,控,控制,保,保藏,温,温度,，,，培,养,养瓶,或,或试,管,管应,严,严格,密,密封,。,。,这一,方,方法,虽,虽简,便,便易,行,行，,但,但不,适,适宜,多,多数,微,微生,物,物的,长,长期,保,保藏,。,。,超低温,冷,冷冻保,藏,藏技术,(-60,一,-80,),要求长,期,期保藏,的,的微生,物,物菌种,，,，一般,都,都要求,在,在,-60,以下进,行,行保藏,。,。,在超低,温,温冷藏,柜,柜中保,藏,藏菌种,的,的一般,方,方法是,：,：,1,离心,收,收获对,数,数生长,中,中期至,后,后期的,微,微生物,细,细胞；,2,用新,鲜,鲜培养,基,基重新,悬,悬浮所,收,收获的,细,细胞；,3,加入,等,等体积,的,的,20,甘油,或,或,10,二甲,亚,亚砜；,4,混匀,后,后分装,入,入冷冻,指,指管或,安,安瓿中,，,，于,-70,超低温,冰,冰箱中,保,保藏。,冻干保,藏,藏,冷冻干,燥,燥的基,本,本方法,：,：是通,过,过在减,压,压条件,下,下使冻,结,结的细,胞,胞悬液,中,中的水,分,分升华,，,，使培,养,养物干,燥,燥。此法是,微,微生物,菌,菌种长,期,期保藏,的,的最为,有,有效的,方,方法之,一,一。,冷冻干,燥,燥过程,中,中必须,使,使用冷,冻,冻保护,剂,剂，目,前,前国内,常,常用脱,脂,脂乳和,蔗,蔗糖，,国,国外尚,有,有运用,动,动物血,清,清等的,。,。,大部分,微,微生物,菌,菌种可,以,以在冻,干,干状态,下,下保藏,10,年之久,而,而不丧,失,失活力,。,。而且,经,经冻干,后,后的菌,株,株无需,进,进行冷,冻,冻保藏,，,，便于,运,运输。,冻干菌,种,种的保,藏,藏与再,生,生,1,保藏,：,：冷冻,干,干燥后,的,的培养,物,物在低,于,于,5,下保藏,。,。较低,的,的保藏,温,温度,(-20,-70,),对于培,养,养物的,长,长期稳,定,定更好,。,。,2,复苏,：,：,(1),在超净,工,工作台,中,中用,70,酒精,棉,棉球擦,洗,洗安瓿,，,，然后,用,用砂轮,在,在安瓿,中,中锉一,道,道沟。,(2),用无菌,纱,纱布或,无,无菌毛,巾,巾包好,安,安瓿，,然,然后用,手,手掰开,安,安瓿。,(3),在安瓿,中,中加入,0.5,1ml,营养液,体,体培养,基,基，慢,慢,慢旋转,安,安瓿，,使,使冻干,菌,菌种复,水,水。然,后,后将此,转,转接到,一,一含有,再,再生培,养,养基的,无,无菌试,管,管中，,或,或直接,接,接种琼,脂,脂斜面,或,或涂布,平,平板。,(4),在指管,中,中冻干,的,的菌种,通,通常为,絮,絮粉状,，,，可以,将,将此直,接,接振落,入,入盛有,l,2ml,液体培,养,养基的,试,试管中,，,，轻轻,振,振荡,5,l0min,，然后,用,用此悬,液,液接种,适,适宜的,再,再生培,养,养基。,细菌的,保,保藏,菌种的,衰,衰退与,复,复壮,菌种衰,退,退的特,点,点：,大量群,体,体中的,自,自发突,变,变,菌种的,复,复壮：,1,）从衰,退,退的菌,种,种群体,中,中把少,数,数个体,再,再找出,来,来，重,新,新获得,具,具有原,有,有典型,性,性状的,菌,菌种。,a,）,纯种分,离,离；,b,）通过,寄,寄主体,进,进行复,壮,壮；,2,）有意,识,识地利,用,用微生,物,物会发,生,生自发,突,突变的,特,特性，,在,在日常,的,的菌种,维,维护,工,工作中,不,不断筛,选,选“正,变,变”个,体,体。,衰退的,防,防止：,1,控制,传,传代次,数,数,2,创造,良,良好的,培,培养条,件,件在实践,中,中，有,人,人发现,如,如创造,一,一个适,合,合原种,的,的生长,条,条件，,就,就可在,一,一定程,度,度上防,止,止菌种,衰,衰退。,如改变,培,培养基,成,成分、,改,改变培,养,养温度,等,等。,3,利用,不,不同类,型,型的细,胞,胞进行,接,接种传,代,代,。,用灭过,菌,菌的棉,团,团,进行孢,子,子接种,，,，不同,孢,孢子的,接,接种尝,试,试。,4,采用,有,有效的,菌,菌种保,藏,藏方法,，,有必要,研,研究和,采,采用更,有,有效的,保,保藏方,法,法以防,止,止菌种,生,生产性,状,状的衰,退,退,菌种的,复,复壮,1,纯种,分,分离,2,通过,宿,宿主体,内,内生长,进,进行复,壮,壮,。,对于寄,生,生性微,生,生物的,退,退化菌,株,株，可,通,通过接,种,种至相,应,应的昆,虫,虫或动,、,、植物,宿,宿主体,内,内的措,施,施来提,高,高它们,的,的致病,性,性。,3,淘汰,已,已衰退,的,的个体,，如低,温,温抗性,筛,筛选。,