下一代测序技术简介

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Next Generation Sequencing(NGS),技术简介,Sanger,测序,Sanger,测序法仍然为基因测序行业内的金标准，但鸟枪测序法在技术上存在瓶颈。（价格昂贵、步骤繁琐、效率低）,NGS=Next Generation Sequencing,NGS,也称为高通量测序,High-throughput Sequencing(HTS),第一代测序：,Sanger Sequencing,（,Sanger,测序）,第二代测序：,NGS=Massively Parallel Sequencing,（大规模平行测序）,第三代测序：,NGS=HTS,SingleMolecule Sequencing,（高通量、单分子测序）,目前,NGS,的主要三种测序仪器,三种测序仪在高通量水平、测序准确度、存储格式和技术方法上均有差异。,罗氏,/,454,基因组测序仪,FLX,系统,焦磷酸测序法,光学,230-400,在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大,样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵,illumina,HiSeq2000,/miSeq,可逆链终止物和合成测序法,荧光,/,光学,2x150,很高测序通量,仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用很高,ABI,/SOLiD,5500 xlSOLiD,系统,连接测序法,荧光,/,光学,25-35,很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，所要拼接出人类基因组的试剂成本最低,测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵,公司,平台名称,测序方法,检测方法,大约读长,(,碱基数,),优点,相对局限性,三大测序平台的技术特点和差异,Roche 454,测序原理,Roche 454,焦磷酸测序原理,Roche 454,测序步骤,样品处理主要是针对大片段的,DNA,分子，如基因组,DNA,、,Fosmid,或,BAC,质粒等，利用超声或氮气打断将这些,DNA,分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择,500-800bp,的,DNA,片段。对于非编码,RNA,或,PCR,产物，则不需要这一步骤。,一、样品处理,Roche 454,测序步骤,二、文库制备,文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，,454,的文库接头分,A,、,B,两种，各,44bp,，由,20bp,的,PCR,引物、,20bp,的测序引物及,4bp,（,TCAG,）的“,key,”碱基构成，其中,B,接头的,5,端带有生物素（,Biotin,）标记，用于磁珠纯化步骤。,Roche 454,测序步骤,三、连接微珠,将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（,water-in-oil,）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（,microreactor,）中将只包含一个磁珠和一条单链,DNA,，通过控制条件，,1mL,乳液中可以形成至少,10,的,6,次方个理想的微反应器。,Roche 454,测序步骤,四、,emRCR,PCR,扩增后，每一个磁珠上将形成密集的,DNA,簇，这些,DNA,序列完全相同，即可用于后续的步骤。,乳液,PCR,（,emRCR,）,Roche 454,测序步骤,五、反应板准备、上机测序,454,测序的反应板称为,PTP,（,Pico Titer Plate,），含有,350,万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为,29m,，而测序磁珠的直径为,20m,，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。,Roche 454,测序步骤,六、测序和分析,将磁珠与测序试剂加入,PTP,中，使之可用于上机测序。,在,454,测序仪中，,A,、,T,、,G,、,C,四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（,PPi,），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。,Illumina,测序原理,Illumina,合成测序原理,Illumina,测序流程,桥式,PCR,合成法测序,数据读取,ABI SOLiD,测序原理,ABI SOLiD,连接测序原理,ABI SOLiD,测序流程,制备,DNA,文库,乳液,PCR/,微珠富集,连接酶测序,:SOLiD,连接反应的底物是,8,碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链,DNA,模板链配对。这样经过五轮测序反应后便可以得到所有的碱基序列,SOLID,的双碱基编码矩阵,ABI SOLiD,连接测序原理,探针的,5,末端标记了,1,种颜色的荧光染料。探针,3,端,1,5,位为随机碱基，其中第,1,、,2,位构成的碱基对表征探针染料类型，而,3,5,位的“,n”,为随机碱基，,6,8,位的“,z”,是可以和任何碱基配对的特殊碱基。,SOLiD,测序反应的每一轮测序反应会连接第,15,位的碱基，同时切除第,68,位的碱基，同时记录下第,12,位碱基决定的荧光颜色。,ABI SOLiD,连接测序原理,ABI SOLiD,连接测序原理,两个碱基共同决定一个颜色，可以极大的提高测序的准确率。,ABI SOLiD,连接测序原理,五轮测序反应反应后，按照第,0,、,1,位，第,1,、,2,位,.,的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“,0,，,1,，,2,，,3”,组成的,SOLiD,原始颜色序列。,454平台的突出优势是读长。目前454系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如从头拼接和环境微生物组学，它仍是最理想的选择。,各个测序平台的特点总结,Roche 454,Illumina,1.,可扩展的超高通量,Genome Analyzer,系统目前每次运行后可获得超过,20 GB,的高品质过滤数据。经优化后通量还有望上升到,95 GB,，相当于人类基因组的,30,倍覆盖度。,2.,需要样品量少,Genome Analyzer,系统需要的样品量低至,100ng,，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。,3.,简单、快速、自动化,Genome Analyzer,系统提供了最简单和简洁的工作流程。制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。自动化的流程不减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。,1.,无以伦比的通量,目前,SOLiD 3,系统单次运行能产生,50 GB,的人基因组序列数据，相当于基因组的,17,倍覆盖度，这显然是其他任一台新一代测序系统都无法达到的,2.,准确性。,新的超精确检测模块（,ECC,模块）将提供高达,99.99%,的精确性；多达,98%,的可定位碱基的质量值高于,45,；更多标签以提高灵敏度和动态范围；高准确性的原始读序，支持无参考序列的数据分析。,各个测序平台的特点总结,ABI SOLiD,公司,平台名称,测序方法,检测方法,大约读长,(,碱基数,),优点,相对局限性,太平洋生物科学公司,（,PacBio,）,PacBio RS,实时单分子,DNA,测序,荧光,/,光学,1000,高平均读长，比第一代的测序时间降低；不需要扩增；最长单个读长接近,3000,碱基,并不能高效地将,DNA,聚合酶加到测序阵列中；准确性一次性达标的机会低（,81-83%,）；,DNA,聚合酶在阵列中降解；总体上每个碱基测序成本高（仪器昂贵）；,Complete Genomics,GeXP,遗传分析系统,复合探针锚杂交和连接技术,荧光,/,光学,10,在第三代中通量最高；在所有测序技术中，用于拼接一个人基因组的试剂成本最低；每个测序步骤独立，使错误的累积变得最低,低读长；模板制备妨碍长重复序列区域测序；样品制备费事；尚无商业化供应的仪器,Ion Torrent,/,Life Technology,个人基因组测序仪（,PGM,）,合成测序法,以离子敏感场效应晶体管检测,pH,值变化,100-200,对核酸碱基的掺入可直接测定；在自然条件下进行,DNA,合成（不需要使用修饰过的碱基）,一步步的洗脱过程可导致错误累积；阅读高重复和同种多聚序列时有潜在困难；,第三代测序平台的比较差异,太平洋生物科学公司（PacBios）实时单分子测序方案示意图。A.单个零点启动模式波导纳米结构的侧面图，每个纳米结构含一个DNA聚合酶分子，固定于底部的玻璃面上。波导纳米结构和共焦成像系统确保只对底部进行荧光检测。B.显示了荧光标记的核苷酸底物掺入测序模板的过程。相应的瞬时荧光探测分为5个步骤。,太平洋生物科学公司,Life Technology,公司,IonTorrent半导体测序芯片技术图示。A.该芯片结构设计的逐层显示图。上层为单个的DNA聚合反应的微池，底部两层构成场效应晶体管离子传感器。每个微池有其相对应的场效应晶体管探头，以鉴别每一个pH值的变化。B.侧面图：微池中，DNA聚合酶将两个重复的TTP核苷酸掺入测序片段中。反应过程中释放出的氢离子被下方的场效应晶体管检测到。,Complete Genomics,公司,Complete Genomics公司的DNB阵列生产和cPAL技术的方案示意图。A.待测片段的设计，DNA纳米球的合成，用来放置纳米球规则排列的纳米阵列-这些可以显示DNA纳米球阵列的形成过程；B.图示：用对应于一个独特接头位点的5个碱基的一组普通探针进行测序过程。图中也显示了标准锚定序列和延伸锚定序列。,