羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作技术与原理,动物细胞培养,细胞培养方式大致可分为两种：,一种是群体培养（massculture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；,另一种是克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。,此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁。,群体培养（左）和克隆培养（右）,细胞培养基本条件,1、合适的细胞培养基,合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养,和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。,2、优质血清,目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。,3、无菌无毒细胞培养环境,无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。,4、恒定的细胞生长温度,维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。,5、合适的气体环境,气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。,正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫HenriettaLacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。,原代培养（primaryculture）,：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。,细胞株（cellstrain）：,从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。,细胞系（cellline）：,从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖,克隆（clone）：,亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,培养细胞的生长和增殖过程,体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫,传代（Passage或Subculture）,。,每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。,所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。,正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：,1原代培养（Primary Culture）期；,2传代期；,3衰退期。,1原代培养（Primary Culture）期,也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。,此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。,初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，多呈二倍体核型。,2传代期,初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。,在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。,为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。,一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期,3衰退期,此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。,在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。,组织培养细胞一代生存期,所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增（Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：,1潜伏期,细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。,接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。,贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。,细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。,细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。,2指数增生期,这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。,指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天，细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。,肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。,3停滞期（Stagnate Phase）：,细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。,此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。,此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。,细胞培养基应用选择,选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：,(1 ）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。,(2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。,(3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640 。,(4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,细胞系,细胞类型,种,组 织,培养基,HeLa,上皮细胞,人,子宫颈癌,MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA,HEp-G2,上皮细胞,人,肝细胞癌,MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA,HT-1080,上皮细胞,人,纤维肉瘤,MEM, 10% HI 胎牛血清 和 NEAA,HT-29,上皮细胞,人,结肠腺癌,McCoy5A, 10% 胎牛血清,JEG-2,上皮细胞,人,绒毛膜癌,MEM, 10% 胎牛血清,KB,上皮细胞,人,口腔癌,MEM, 10% 胎牛血清和NEAA,Saos-2,上皮细胞,人,骨肉瘤,McCoy5A, 15% 胎牛血清,羊水细胞,人,羊水,F10培养基、胎牛血清,绒毛细胞,人,绒毛枝,F10培养基、胎牛血清,细胞培养环境,1、实验室设计,细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。,2、常用设施及设备,（,1,）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。,（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。,操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物,洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。,分析间：显微镜、计算机及打印机等。,细胞培养无菌操作基本技术,工作环境的处理,使用层流超净工作台是最经济有效的手段。超净工作台正常工作时，向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。,（1）实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60 分钟灭菌，用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用70% 酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10 分钟后，才可进行下一个实验操作。,（2）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。,（3）小心取出无菌实验用品，避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手夾住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。,（4）工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐物品伤人等。,（5）定期检查下列项目：CO,2,钢瓶内的CO,2,压力；CO,2,培养箱内的CO,2,浓度、温度、及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及HEPA 过滤器滤膜，预滤网300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA）。,人羊水细胞培养及染色体制备,人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可区分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。,E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。,AF细胞在再培养中一开始就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。,F细胞在再培养中潜在的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。,通常在培养后34天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合再培养作染色体分析。大约在第7天出现的AF细胞可被用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。,实验用品、实验试剂,见实验操作手册,内容与方法,（一）细胞接种与培养,在无菌条件下抽得妊娠18-22周羊水后，注入10ml离心管中，共抽4管约32ml，立即送检,进室后，以1500rpm离心10min,进无菌室，在无菌操作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入约4.5ml完全培养基入管内，吸管轻混匀，移至25cm,2,方形培养瓶中置含5%CO,2,的37温箱行开放式培养,一般5天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上换液用培养基，继续培养24-48小时，如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml, (20ug/ml，7号针头垂直加2滴)4-6小时左右行细胞学处理,（二）细胞收获,倒出瓶中细胞液入10ml离心管，0.85%NaCl冲洗细胞壁两遍,0.25% EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞。,收集细胞悬液：离心，1500rpm，10min，去上清,低渗：加入0.075M KCl 4ml-6ml，吸管吹打，37水浴3min-5min(或04%柠檬酸钠11作为低渗液,每管8ml，低渗10min)。,预固定：加入1.5ml左右，轻混匀37水浴5min， 离心,1500rpm,10min。,固定：加入3:1固定剂8ml左右，轻混匀，37水浴10min,室温1500rpm离心10min，去上清，约留0.5ml,重复固定：同上,离心，1500rpm，10min，去上清,调悬液：视管底细胞量加入几滴新鲜固定剂，并吹打混匀,滴片：每片1-2滴, 滴片4-6张,烤片：75烤箱烘烤3小时,第二天行显带处理：同外周血,注意事项,羊水标本应及时送检，送检过程中不宜受热或冰冻，实验人员收到羊水后应先观察羊水是否清亮，含胎脂的多少及是否为血性羊水；羊水中少量红细胞不需处理,如有明显血性羊水,立即在羊水中加入无菌肝素一滴。,接种所用器皿要进行严格的灭菌处理。,离心时，一定要注意离心机内温度，必须达到室温方可离心。,培养基pH为也是羊水细胞开放式培养成功的关键。,注意接种时培养基不能加得过多，卧倒瓶子时，培养基不能接触瓶盖；,羊水培养首先必须有好的培养基,传统的培养基是在F10中加入一定比例的胎牛血清,由于营养成份较少,羊水细胞培养所需时间较长,培养成功率低。,国内有些学者通过添加生长因子或用血清代用品来培养羊水,但步骤繁琐,也容易造成污染。,要根据细胞的生长状况，来决定所要收获的时间。,抓住细胞生长旺盛时期相当重要，如羊水为血性羊水或胎质较多须给予不同的处理。,要收获较多的分裂相,必须在适当的时机收获。,收获标准：于10倍目镜和4倍物镜下观察:,以梭长形羊水细胞(AF细胞)为主要类型的生长细胞,形成的细胞克隆覆盖1个或1个以上的完整视野。,培养瓶中有23个以上细胞克隆,且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、双圆形或葡萄状透亮细胞。,细胞克隆中央的细胞开始老化,克隆周边细胞生长旺盛。,收获细胞时要掌握好低渗时间及低渗液的量，吹打时力度要均匀，滴片浓度不能太高，以免细胞不分散。培养收获时间大多数为910天,最早收获在第7天,最长14天。显带时，胰酶消化时间一般比外周血要稍长，但需根据其胰酶活性而定。,绒毛细胞培养与染色体制备,绒毛细胞由受精卵发育分化的滋养层细胞及绒毛间质中的胚外中胚层细胞组成，绒毛细胞与胎儿组织同源，通过绒毛检测，可客观反映胎儿情况。绒毛既可以直接制片进行染色体的观察，也可以经培养制备染色体，进行产前诊断。,内容与方法,挑选孕6-8周孕妇，询问病史、进行妇科检查，以确定早孕，了解子宫大小，位置、弯曲情况及胚胎着床情况,拭去宫颈粘液，严密消毒宫颈及宫颈管下段，一般可不用宫颈钳，如子宫过度前屈或后屈，则有助手用宫颈钳轻拉子宫向下固定,用消毒塑料吸管按子宫的自然弯曲方向，沿着子宫壁轻轻进入子宫腔，直至有阻力感为止，一般进入子宫颈外口6-10cm（根据妊娠天数及宫颈长度而定）切忌反复进退，以防剥离面大，然后用空针抽吸，同时退出塑料管，大多可吸出少许血液，绒毛枝便夹在其中,在无菌条件下，将绒毛组织放入玻璃平皿中，用含400U/ml双抗的0.85%NaCl反复冲洗绒毛组织2-3次以去除血液，然后除去并吸净生理盐水,（一）消化法,（1）经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，在玻璃平皿用眼科手术剪将绒毛组织剪碎,放入装有30-50倍组织量的0.25% EDTA-trypin的三角烧瓶中，37下,20-30min即可,(2)将三角烧瓶中的组织溶液装入离心管，离心,1000rpm,10min,(3)去上清，加入20 ml PBS,打匀,(4)离心,1000rpm,10min,(5)去上清，加入20 ml PBS,打匀,(6)细胞计数：10,6,/25cm,2,接种,(二)贴壁法,经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，在玻璃平皿用眼科手术剪剪成1-2mm,3,小枝或小块，移入25cm,2,培养瓶中，用牙科探针将组织均匀分散于培养瓶的细胞贴壁面，组织块的间距约为0.5cm-1cm,于对侧瓶壁加入含50%血清的培养基，pH为，37培养2-3小时待组织贴壁牢固后，即可翻瓶，使组织块泡在培养液中,(三)收获细胞及染色体制片,每天观察，一般3-7天可见上皮样或成纤维样细胞生长。根据生长情况每隔5-7天换液一次。一般培养6-20天，待细胞生长旺盛时，按下列程序处理：,加入秋水仙素让其过夜，约14小时左右,或秋水仙素0.04-0.08ug/ml,4-6h收获,将培养液倒入离心管中，加入PBS或生理盐水2-3毫升，洗净完全培养基，加0.25% EDTA-trypsin约2ml消化3-5min，完全培养基终止消化。置离心管中离心，1500rpm ，10min,低渗：加入0.075M KCl 4ml-6ml，吸管吹打，37水浴3min-5min(或04%柠檬酸钠11作为低渗液,每管8ml，低渗10min),预固定：加入1.5ml左右，轻混匀37水浴3min，离心,1500rpm,10min,固定：加入3:1固定剂8ml左右，轻混匀，37水浴15min,室温1500rpm离心10min，去上清，约留0.5ml,重复固定：同上,离心，1500rpm，10min，去上清,视管底细胞量加入适当几滴新鲜固定剂,滴片：每片1-2滴, 滴片4-6张,烤片：75烤箱烘烤3小时,第二天行显带处理：同外周血,注意事项,严格无菌操作是培养成功的关键；,视细胞分裂旺盛情况加秋水仙素、 4-6小时也可考虑收获；,在用0.25% EDTA-trypsin消化之前尽量将瓶壁血清洗净，更有利于快速消化；,低渗之后每一步均应轻吹打，用力过大可能损失掉较多细胞。,Thank you!,