第五章分子生物学研究方法-20220313230

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,五,五,章,章,分,分,子,子,生,生,物,物,学,学,研,研,究,究,方,方,法,法,1,、,、,重,重,组,组DNA,技,技,术,术,发,发,展,展,史,史,上,上,的,的,重,重,大,大,事,事,件,件,2,、,、DNA,操,操,作,作,技,技,术,术,3,、,、,基,基,因,因,克,克,隆,隆,的,的,主,主,要,要,载,载,体,体,系,系,统,统,4,、,、,基,基,因,因,的,的,分,分,离,离,与,与,鉴,鉴,定,定,分,子,子,生,生,物,物,学,学,从,从20,世,世,纪,纪,中,中,叶,叶,开,开,始,始,高,高,速,速,发,发,展,展,，,，,最,最,主,主,要,要,的,的,原,原,因,因,之,之,一,一,是,是,基,基,因,因,操,操,作,作,和,和,基,基,因,因,工,工,程,程,技,技,术,术,的,的,进,进,步,步,。,。,基,基,因,因,操,操,作,作,：,：DNA,的,的,切,切,割,割,和,和,连,连,接,接,、,、,核,核,酸,酸,分,分,子,子,杂,杂,交,交,、,、,凝,凝,胶,胶,电,电,泳,泳,、,、,细,细,胞,胞,转,转,化,化,、,、,核,核,酸,酸,序,序,列,列,分,分,析,析,、,、,基,基,因,因,的,的,人,人,工,工,合,合,成,成,、,、,定,定,点,点,突,突,变,变,和,和PCR,扩,扩,增,增,。,。,这,这,是,是,分,分,子,子,生,生,物,物,学,学,研,研,究,究,的,的,核,核,心,心,技,技,术,术,。,。基因工程：在体外将核,酸,酸分子插入,载,载体分子中,，,，使之进入,寄,寄主细胞内,并,并进行持续,稳,稳定的繁殖,和,和表达。,跨越天然物,种,种屏障、把,来,来自任何生,物,物的基因置,于,于毫无亲缘,关,关系的新的,寄,寄主生物细,胞,胞之中的能,力,力，是基因,工,工程技术区,别,别于其他技,术,术的根本特,征,征。本章将,在,在回顾重组DNA技术,史,史上主要事,件,件的基础上,，,，讨论DNA操作技术,、,、基因克隆,的,的常用载体,系,系统以及基,因,因的分离与,鉴,鉴定等3个,环,环节。,51,重,重组DNA技术史,上,上的重大事,件,件,半个世纪以,来,来，分子生,物,物学研究取,得,得了前所未,有,有的进步，,主,主要有3大,成,成就: 第,一,一，解决了遗传的物质,基,基础问题基因的,分,分子载体是DNA;,第,第二，DNA分子的双,螺,螺旋结构模,型,型和半保留,复,复制机制，,解,解决了基因的自我,复,复制和世代,交,交替问题; 第三，,“,“中心法则,”,”和操纵子,学,学说，成功,地,地破译了遗,传,传密码，阐,明,明了遗传信息的,流,流动与表达,机,机制。,DNA分子,体,体外切割与,连,连接技术及,核,核苷酸序列,分,分析技术的,进,进步直接推,动,动了重组DNA技术的,产,产生和发展,。,。,重组DNA,的,的核心是用,限,限制性核酸,内,内切酶和DNA连接酶,对,对DNA分,子,子进行体外,切,切割和连接,。,。这些酶的发,现,现和应用是,现,现代生物工,程,程技术史上,最,最重要的事,件,件。限制性,核,核酸内切酶,能,能从特定碱,基,基序列位点,切,切开DNA,。,。1972,，,，Boyer实验室发,现,现核酸内切,酶,酶EcoRI能特异识,别,别GAAUC序列，将DNA在这,个,个位点切开,产,产生具有粘,性,性末端的小,片,片段。,他们还发现,，,，EcoRl酶切产生,的,的任何不同,来,来源的DNA片段能通,过,过粘性末端,之,之间碱基互,补,补作用而彼,此,此“粘合”,起,起来。,此后，大量,类,类似于,Ero,Rl但具有,独,独特识别序,列,列的核酸内,切,切酶被陆续,发,发现。到目,前,前为止，科,学,学家已经几,乎,乎能随心所,欲,欲地把任何DNA分子,切,切割成一系,列,列不连续的,片,片段，再利,用,用凝胶电冰,技,技术将这些,片,片段按照分,子,子量大小逐,一,一分开，以,供,供下一步研,究,究。,52DNA,操,操作技术,植物基因组DNA的提,取,取：液氮对,植,植物组织进,行,行研磨,破,破碎细胞。,细,细胞提取液,中,中含有的SDS溶解膜,蛋,蛋白而破坏,细,细胞膜，使,蛋,蛋白质变性,而,而沉淀下来,。,。EDTA,抑,抑制DNA,酶,酶的活性。,再,再用酚、氯,仿,仿抽提的方,法,法去除蛋白,，,，得到的DNA溶液经,乙,乙醇沉淀。,材料1三羟甲,基,基氨基甲烷(Tris)2乙二胺,四,四乙酸(EDTA)3,氯,氯化钠4,巯基乙醇5,氯,氯化钾6异丙,醇,醇7乙醇8,琼,琼脂糖9十,二,二烷基硫酸,钠,钠(SDS) 10,EP管11,，,，陶瓷研钵12加样枪,和,和吸头13氯仿14,酚,酚,试剂1细,胞,胞提取液（100mmol/LTrisHCl=50/26.8 pH80）(100mL分装为10mL)，5mmoI/LEDTA，500mmol/LNaCl1.25% SDS lmol/L,琉基乙醇25mol/L KCl,将细胞提取,液,液、KCl,溶,溶液及容器,灭,灭菌。新鲜,叶,叶片，在液,氮,氮中研磨，,分,分装在2只EP管中。,加,加入740,L细胞提取,液,液，充分混,匀,匀。65,水,水浴保温20min。,从,从水浴中取,出,出离心管，,加,加入20,L5mol/LKCl,溶,溶液，混匀,，,，冰浴20min。8000r/min离心10min,。,。将上清液,转,转移到另一EP管中。,加,加等体积酚/氯仿混匀,，,，2000r/min,离,离心5min，取上清,。,。加等体积,氯,氯仿，混匀,，,，12000r/min，离心5min，取,上,上清。加入061,倍,倍体积的异,丙,丙醇(沉淀DNA)，,混,混匀。离心,获,获得沉淀，70%乙醇,洗,洗3次。风,干,干沉淀。,521,核,核,酸,酸的凝胶电,泳,泳,1基本原,理,理 生物,大,大分子在一,定,定pH条件,下,下，通常会,带,带电荷。将,其,其放置到电,场,场中，就会,以,以一定的速,度,度移向适当,的,的电极。分,子,子在电场作,用,用下的迁移,速,速度，与电,场,场强度和电,泳,泳分子所携,带,带的净电荷,数,数成正比，,与,与分子的摩,擦,擦系数成反,比,比。摩擦系,数,数是分子大,小,小、极性及,介,介质粘度的,函,函数。根据,分,分子大小、,构,构型或形状,的,的差异和带,净,净电荷数，,可,可通过电泳,将,将蛋白质或,核,核酸分子混,合,合物中的各,种,种成分彼此,分,分离。,在生理条件,下,下，核酸分,子,子之糖-磷,酸,酸骨架中的,磷,磷酸基团，,呈,呈离子化状,态,态，DNA,和,和RNA多,核,核苷酸链称,为,为多聚阴离,子,子，把它们,放,放置在电场,当,当中，会向,正,正电极的方,向,向迁移。由,于,于糖-磷酸,骨,骨架在结构,上,上的重复性,质,质，相同数,量,量的双链DNA几乎具,有,有等量的净,电,电荷，因此,它,它们能以同,样,样的速度向,正,正电极方向,迁,迁移。在一,定,定的电场强,度,度下，DNA分子的迁,移,移速度，取,决,决于核酸分,子,子本身的大小和构型。这就是应,用,用凝胶电泳,技,技术分离DNA片段的,基,基本原理。,第五章,分,分子生物学,研,研究方法,2琼脂糖,凝,凝胶电泳,琼脂糖是一,种,种线性多糖,聚,聚合物。将,琼,琼脂糖粉末,加,加热到熔点,后,后冷却凝固,便,便会形成良,好,好的电泳介,质,质。经过化,学,学修饰的低,熔,熔点琼脂糖,，,，在较低的,温,温度下便会,熔,熔化，常用,于,于DNA片,段,段的制备电,泳,泳。,琼脂糖凝胶,分,分辨DNA,片,片段的范围,为,为0.250kb之,间,间;聚丙烯,酰,酰胺凝胶分,辨,辨范围为1,1000bp之间。,凝,凝胶浓度的,高,高低影响凝,胶,胶介质孔隙,的,的大小，浓,度,度越高，孔,隙,隙越小，其,分,分辨能力就,越,越强。例如,，,，20%的,聚,聚丙烯酰胺,凝,凝胶可分离1-6bp,的,的DNA小,片,片段，而若,要,要分离1000bp的DNA片段,，,，就要用3%的聚丙烯,酰,酰胺凝胶。,再,再如，2%,的,的琼脂糖凝,胶,胶可分离300bp的,双,双链DNA,分,分子，而分,离,离大片段DNA就要用,低,低浓度(0.3%1.0%)的,琼,琼脂糖凝胶,。,。,在凝胶电泳,中,中，加入适,量,量嗅化乙锭(ethidiumbromide，简称EB)染料,对,对核酸分子,进,进行染色，,然,然后将电泳,标,标本放置在,紫,紫外光下观,察,察，检测灵,敏,敏快捷，DNA带中含0.05g的微量DNA，可以,清,清晰地检测,出,出来。EB,能,能插入到DNA或RNA分子的相,邻,邻碱基之间(图5-4)，并在300nm波,长,长的紫外光,照,照射下发出,荧,荧光。把EB直接加到,凝,凝胶介质中,，,，染料便会,与,与DNA分,子,子结合，却,不,不能与凝胶,相,相结合。这,样,样就只有DNA分子能,吸,吸收EB并,发,发出荧光。,在,在适当的染,色,色条件下，,荧,荧光强度与DNA片段,的,的数量成正,比,比。,5.2.2,核,核酸的分,子,子杂交,将特定的单,链,链DNA或RNA混合,在,在一起，其,相,相应的同源,区,区段（互补,）,）就会退火,形,形成双链结,构,构。如果退,火,火的核酸来,自,自不同的生,物,物有机体，,所,所形成的双,链,链分子就被,称,称为杂种核,酸,酸分子。能,够,够杂交形成,杂,杂种分子的,不,不同来源的DNA分子,，,，其亲缘关,系,系较为密切,；,；反之，其,亲,亲缘关系则,比,比较疏远。,因,因此，DNA/DNA,的,的杂交作用,，,，可以用来,检,检测特定生,物,物有机体之,间,间是否存在,着,着亲缘关系,，,，而形成DNA/RNA间杂种分,子,子的能力可,被,被用来揭示,核,核酸片段中,某,某一特定基,因,因的位置。,在大多数核,酸,酸杂交反应,中,中，经过凝,胶,胶电泳分离,的,的DNA或RNA分子,，,，都必须通,过,过毛细管或,电,电导作用被,转,转移到滤膜,上,上，而且是,按,按其在凝胶,中,中的位置原,封,封不动地,吸,吸印上去,的,的，因此，,核,核酸杂交也,被,被称为DNA印迹杂,交,交。由于,该,该方法是E,MSouthern于1975年首先设,计,计出来的，,所,所以又叫做Southern blotting。杂交,中,中常用的滤,膜,膜有尼龙滤,膜,膜、硝酸纤,维,维素滤膜和,二,二乙氨基乙,基,基纤维素滤,膜,膜(DEAE)等。,核酸分子杂,交,交包括两个,步,步骤：第一,，,，将样品转,移,移到滤膜（,印,印迹转移）;第二，将,滤,滤膜与DNA或RNA,探,探针进行杂,交,交。具体步,骤,骤：1、转,移,移。2、在80下烘,烤,烤12h,或,或用紫外线,交,交联法将DNA片段永,久,久性地固定,在,在滤膜上。3、放入探,针,针溶液中进,行,行核酸杂交,。,。一旦与滤,膜,膜上的单链DNA杂交,之,之后，就很,难,难再解链。4、用漂洗,法,法去掉没有,杂,杂交上的探,针,针分子。放,射,射性同位素,标,标记的探针,可,可检测2ng ；为了,安,安全，我们,用,用DIG（,地,地高辛）标,记,记探针，荧,光,光法检测杂,交,交信号,。,基因组DNA被限制性,内,内切酶酶切,为,为DNA片,段,段；各片段,经,经电泳后在,凝,凝胶分为条,带,带；（c）,中,中由下到上,是,是：玻璃板,、,、一层滤纸,、,、凝胶、滤,膜,膜、很多层,滤,滤纸、玻璃,板,板、重物。,通,通过毛细管,作,作用将凝胶,上,上的DNA,条,条带原封不,动,动地吸印到滤膜上,去,去。（d）,在,在80下,烘,烘烤12h或用紫外,线,线交联法将DNA片段,永,永久性地固,定,定在滤膜上,并,并形成单链,。,。(e)滤膜放入带,标,标记的DNA或RNA,核,核酸探针溶,液,液中进行核,酸,酸杂交。,523,细,细菌转,化,化,细菌转化是,指,指一种细菌,菌,菌株由于捕,获,获了外源DNA而导致,性,性状特征发,生,生遗传改变,的,的生命过程,。,。,大肠杆菌是,分,分子生物学,家,家常用的实,验,验材料，也,是,是基因工程,重,重要的实验,菌,菌株。将快,速,速生长中的,大,大肠杆菌置,于,于经低温(0)预处,理,理的低渗氯,化,化钙溶液中,，,，便会造成,细,细胞膨胀(,形,形成原生质,球,球)，并与,转,转化混合物,中,中的外源DNA形成粘,附,附在细胞表,面,面的复合物,。,。立即将该,体,体系转移到42下做,短,短暂的热刺,激,激，复合物,便,便会被细胞,所,所吸收。发,生,生了遗传改,变,变的菌株带,着,着变异而遗,传,传。,524,核,核,苷,苷酸序列分,析,析,仪器分析发,展,展很快。,如果将来做,测,测序工作，,有,有了分子生,物,物学基础，,就,就可以做。,如果将来工,作,作中需要测,序,序，一般送,到,到公司去测,。,。,525,基,基,因,因扩增,聚合酶链式,反,反应，即PCR技术，,是,是一种在体,外,外快速扩增,特,特定基因或DNA序列,的,的方法。它,可,可以在试管,中,中建立反应,，,，经数小时,之,之后，就能,将,将极微量的,目,目的基因或,某,某一特定的DNA片段,扩,扩增数十万,乃,乃至千百万,倍,倍。,PCR技,术,术的,原,原理,首先,将,将双,链,链DNA,分,分子,在,在临,近,近沸,点,点的,温,温度,下,下加,热,热分,离,离成,两,两条,单,单链DNA分,子,子，DNA聚,合,合酶,以,以单,链,链DNA,为,为模,板,板并,利,利用,反,反应,混,混合,物,物中,的,的四,种,种脱,氧,氧核,苷,苷三,磷,磷酸,合,合成,新,新生,的,的DNA,互,互补,链,链。,因,因为DNA聚,合,合酶,需,需要,有,有一,小,小段,双,双链DNA来,启,启动(,引,引导),新,新链,的,的合,成,成，,所,所以,，,，新,合,合成,的,的DNA,链,链的,起,起点,，,，由,加,加入,到,到反,应,应混,合,合物,中,中的,一,一对,寡,寡核,苷,苷酸,引,引物,在,在模,板,板DNA,链,链两,端,端的,退,退火,决,决定,的,的。,PCR反,应,应的,全,全过,程,程,DNA解,链,链(,变,变性)、,引,引物,与,与模,板,板DNA,相,相结,合,合(,退,退火)、DNA合,成,成(,延,延伸)三,步,步，,被,被不,断,断重,复,复。,多,多次,循,循环,之,之后,，,，反,应,应混,合,合物,中,中所,含,含有,的,的双,链,链DNA,数,数，,即,即两,条,条引,物,物位,点,点之,间,间的DNA区,段,段的,拷,拷贝,数,数，,理,理论,上,上的,最,最高,值,值是2,n,。,具体,说,说：,首,首先,将,将含,有,有待,扩,扩增DNA样,品,品的,反,反应,混,混合,物,物放,置,置在,高,高温(约94,),环,环境,下,下加,热,热1min，,使,使双,链,链DNA,变,变性,，,，形,成,成单,链,链模,板,板DNA,；,；然,后,后降,低,低反,应,应温,度,度(,约,约56)制,冷,冷1min，,使,使引,物,物与,两,两条,单,单链,模,模板DNA发,生,生退,火,火作,用,用并,结,结合,在,在靶DNA区,段,段两,端,端的,互,互补,序,序列,位,位置,上,上；,最,最后,，,，72,左,左右,保,保温1至,数,数分,钟,钟，,在,在DNA,聚,聚合,酶,酶的,作,作用,下,下，,从,从引,物,物的3-端,加,加入,脱,脱氧,核,核苷,三,三磷,酸,酸，,并,并沿,着,着模,板,板按5,3,方,方向,延,延伸,，,，合,成,成新,生,生DNA,互,互补,链,链。,以,以上,循,循环,在,在同,一,一个PCR管,中,中进,行,行。,反,反应,物,物加,完,完后,，,，温,度,度由PCR仪,调,调整,，,，程,序,序完,成,成后,可,可以,拿,拿到,产,产物,。,。,53,基,基,因,因克,隆,隆的,主,主要,载,载体,系,系统5,3,1,质,质粒DNA及,其,其分,离,离纯,化,化,细菌,质,质粒,是,是存,在,在于,细,细胞,质,质中,的,的一,类,类独,立,立于,染,染色,体,体并,能,能自,主,主复,制,制的,遗,遗传,成,成分,，,，质,粒,粒都,是,是由,环,环形,双,双链DNA组,成,成的,复,复制,子,子（,有,有少,量,量线,性,性质,粒,粒、RNA质,粒,粒报,道,道）,。,。质,粒,粒DNA,分,分子,可,可以,持,持续,稳,稳定,地,地处,于,于染,色,色体,外,外的,游,游离,状,状态,，,，也,可,可能,在,在一,定,定的,条,条件,下,下被,可,可逆,性,性整,合,合到,寄,寄主,染,染色,体,体上,，,，随,着,着染,色,色体,的,的复,制,制而,复,复制,，,，并,通,通过,细,细胞,分,分裂,传,传递,到,到后,代,代。,质粒,用,用作,基,基因,克,克隆,的,的载,体,体分,子,子，,获,获得,大,大量,纯,纯化,的,的质,粒,粒DNA,分,分子,很,很重,要,要。,寄主,细,细胞,的,的裂,解,解是,分,分离,质,质粒DNA的,关,关键,步,步骤,，,，加,入,入溶,菌,菌酶,或,或十,二,二烷,基,基硫,酸,酸钠(SDS)来,促,促使,大,大肠,杆,杆菌,细,细胞,裂,裂解,。,。细,胞,胞裂,解,解反,应,应需,要,要相,当,当温,和,和，,同,同时,实,实验,操,操作,又,又十,分,分谨,慎,慎仔,细,细，,这,这样,，,，绝,大,大部,分,分的,染,染色,体,体DNA,分,分子,都,都将,以,以高,分,分子,量,量的,形,形式,释,释放,出,出来,，,，可,以,以用,高,高速,离,离心,的,的方,法,法使,之,之与,细,细胞,碎,碎片,一,一起,被,被沉,淀,淀除,去,去，,得,得到,高,高纯,度,度的,质,质粒DNA。,53,11氯化,铅,铅密度,梯,梯度离,心,心法,质粒DNA一,般,般仅占,细,细胞总DNA,的,的l%,2%,左,左右，,而,而且其,化,化学结,构,构与寄,主,主染色,体,体DNA之间,并,并没有,什,什么差,别,别，所,以,以，质,粒,粒DNA的纯,化,化须从,两,两者高,级,级结构,上,上的差,异,异寻找,依,依据。,在,在细胞,裂,裂解及DNA,分,分离的,过,过程中,，,，大分,子,子质量,的,的细菌,染,染色体DNA,容,容易发,生,生断裂,形,形成相,应,应的线,性,性片段,，,，而质,粒,粒DNA则由,于,于其分,子,子量较,小,小、结,构,构紧密,，,，大部,分,分仍能,保,保持完,整,整的环,状,状结构,。,。,方法：,将,将含有,溴,溴化乙,锭,锭(EtBr)的氯,化,化铯(CsCl)溶,液,液加到,大,大肠杆,菌,菌裂解,液,液中，EtBr分子,便,便会通,过,过嵌入,作,作用而,结,结合到DNA,链,链上，,导,导致双,螺,螺旋结,构,构发生,解,解旋反,应,应。大,肠,肠杆菌,染,染色体DNA,片,片段具,有,有游离,的,的末端,而,而易于,解,解旋，,会,会结合,大,大量的EtBr分子,。,。共价,闭,闭合环,状,状的DNA分,子,子质粒,，,，只能,发,发生有,限,限的解,旋,旋反应,，,，限制,了,了EtBr分,子,子的结,合,合数量,，,，染色,体,体DNA片段,比,比质粒DNA,结,结合更,多,多的EtBr,分,分子。,在DNA-EtBr,复,复合物,中,中，结,合,合的EtBr,分,分子数,量,量越多,，,，其密,度,度也就,越,越低。,因,因此，,在,在EtBr达,到,到饱和,浓,浓度的,条,条件下,，,，质粒DNA,就,就要比,线,线性的,染,染色体DNA,片,片段具,有,有更高,的,的密度,。,。通过,氯,氯化铯,密,密度梯,度,度离心,之,之后，,它,它们就,会,会被平,衡,衡在不,同,同的位,置,置，从,而,而达到,纯,纯化质,粒,粒DNA的目,的,的。,53,12,碱,碱变,性,性法,在pH,值,值介于12.012.5,的,的条件,下,下加热DNA,溶,溶液，,线,线性DNA会,被,被变性,，,，而闭,合,合环状,质,质粒DNA则,不,不会被,变,变性，,尽,尽管在,这,这样的,条,条件下,连,连接DNA互,补,补链之,间,间的氢,键,键也会,断,断开，,但,但由于,闭,闭合环,状,状质粒DNA,的,的双螺,旋,旋主链,骨,骨架的,彼,彼此盘,绕,绕作用,，,，互补,的,的两条,链,链仍然,会,会紧密,地,地结合,在,在一起,。,。,与此相,反,反，线,性,性DNA的两,条,条链则,会,会完全,分,分开。,若,若用制,冷,冷或恢,复,复中性,的,的方法,处,处理DNA混,合,合物，,质,质粒DNA能,迅,迅速而,准,准确地,复,复性，,但,但随机,断,断裂产,生,生的线,性,性染色,体,体DNA分子,，,，彼此,已,已经分,离,离的互,补,补链之,间,间的复,性,性作用,就,就不会,那,那么迅,速,速而准,确,确，往,往,往聚集,形,形成网,状,状结构,，,，与变,性,性的蛋,白,白质及RNA,一,一道被,离,离心沉,淀,淀下来,。,。可以,用,用酒精,沉,沉淀法,收,收集仍,然,然滞留,在,在上清,液,液中的,质,质粒DNA。,碱变性,法,法是目,前,前最流,行,行的分,离,离纯化,质,质粒DNA的,方,方法是,碱,碱变性,法,法。,53,2,重,重要的,大,大肠杆,菌,菌质粒,载,载体53,21pSC101质粒,载,载体,pSC101,是,是低拷,贝,贝数的,大,大肠杆,菌,菌质粒,载,载体，,平,平均每,个,个寄主,细,细胞仅,有,有12个拷,贝,贝。其,分,分子大,小,小为9.09kb,，,，编码,有,有一个,四,四环素,抗,抗性基,因,因(tet,r,)。该,质,质粒具,有,有EcoRI,、,、Hin d,、BamH I,、,、Sal I,、,、Xho I,、,、Pvu ,以,以及SmaI等7,种,种限制,性,性核酸,内,内切酶,的,的单切,割,割位点,，,，在Hind、BamHI和SalI,等,等3个,位,位点克,隆,隆外源DNA,，,，都会,导,导致tet,r,基因失,活,活。,pSClO1,质,质粒,具,具有,可,可插,人,人外,源,源DNA,的,的多,个,个限,制,制性,核,核酸,内,内切,酶,酶的,单,单克,隆,隆位,点,点，,还,还具,有,有四,环,环素,抗,抗性,的,的强,选,选择,记,记号,，,，便,于,于筛,选,选。,因,因此,，,，它,第,第一,个,个被,选,选为,真,真核,基,基因,的,的克,隆,隆载,体,体。,这,这个,质,质粒,载,载体,有,有其,明,明显,的,的缺,点,点，,它,它是,一,一种,严,严紧,型,型复,制,制控,制,制的,低,低拷,贝,贝质,粒,粒，,从,从带,有,有该,质,质粒,的,的寄,主,主细,胞,胞中,提,提取pSClOlDNA,，,，其,产,产量,就,就要,比,比其,他,他质,粒,粒载,体,体低,得,得多,。,。,5322pBR322质,粒,粒载,体,体,为改,进,进转,化,化子,筛,筛选,技,技术,，,，有,必,必要,用,用人,工,工的,方,方法,构,构建,一,一种,既,既带,有,有多,种,种抗,药,药性,的,的强,选,选择,记,记号,，,，又,具,具有,低,低分,子,子质,量,量、,高,高拷,贝,贝以,及,及外,源,源DNA,插,插入,不,不影,响,响复,制,制功,能,能的,多,多种,限,限制,性,性核,酸,酸内,切,切酶,单,单切,割,割位,点,点等,优,优点,的,的新,的,的质,粒,粒载,体,体。,目,目前,，,，在,基,基因,克,克隆,中,中广,泛,泛使,用,用的pBR322,质,质粒,，,，就,是,是按,这,这种,设,设想,构,构建,的,的一,种,种大,肠,肠杆,菌,菌质,粒,粒载,体,体。,pBR322,质,质粒,是,是由3个,不,不同,来,来源,的,的部,分,分组,成,成的:含,有,有氨,卡,卡青,霉,霉素,抗,抗性,基,基因,（,（amp,r,)、四环,素,素抗性基,因,因(tet,r,)和DNA复制起,点,点(ori)(图5-22)。,pBR322质粒,载,载体较小,其长度,为,为4363bp。,不,不仅易于,纯,纯化，而,且,且即使携,带,带上一段,较,较大（6-8kb,）,）的外源DNA片,段,段，操作,起,起来仍较,为,为便利。,pBR322质粒,载,载体具有,两,两种抗生,素,素抗性基,因,因以用作,转,转化子的,选,选择记号,，,，方便选,择,择。例如,，,，将外源DNA克,隆,隆在Bam HI位点上,，,，将这样,的,的重组质,粒,粒转化到,野,野生型大,肠,肠杆菌细,胞,胞中，并,涂,涂布在含,有,有氨卡青,霉,霉素的选,择,择性培养,基,基平板上,，,，那么存,活,活下来的,菌,菌落都将,具,具有Amp,r,的表型，,它,它们也必,定,定是获得,了,了编码有,这,这种抗性,基,基因的转,化,化子。第,三,三个优点,是,是具较高,的,的拷贝数,，,，若经过,氯,氯霉素扩,增,增，每个,细,细胞中可,累,累积10003000个,拷,拷贝，为,重,重组体DNA的制,备,备提供了,极,极大的方,便,便。,533,噬菌体,载,载体,噬菌体是,一,一类细菌,病,病毒的总,称,称，英文,名,名叫作bacteriophage,，,，来源于,希,希腊文“phagos”，,系,系指吞噬,之,之意。如,同,同质粒分,子,子一样，,噬,噬菌体也,可,可以用于,克,克隆和扩,增,增特定的DNA片,段,段，是一,种,种良好的,基,基因克隆,载,载体。作,为,为细菌寄,生,生物的噬,菌,菌体，它,可,可以在脱,离,离寄主细,胞,胞的状态,下,下保持自,己,己的生命,，,，但一旦,脱,脱离了寄,主,主细胞，,就,就既不能,生,生长也不,能,能复制，,这,这是因为,大,大多数的,噬,噬菌体只,能,能利用寄,主,主核糖体,、,、合成蛋,白,白质的因,子,子、各种,氨,氨基酸及,能,能量代谢,体,体系进行,生,生长和增,殖,殖。,噬菌体有,两,两种类型,：,：,1、溶菌,周,周期（烈,性,性噬菌体,）,）：噬菌,体,体将其感,染,染的寄主,细,细胞转变,成,成为噬菌,体,体的“制,造,造厂”，,产,产生出大,量,量的子代,噬,噬菌体颗,粒,粒。,2、溶源,生,生长周期,（,（温和噬,菌,菌体）：,在,在感染过,程,程中没有,产,产生出子,代,代噬菌体,颗,颗粒，噬,菌,菌体DNA被整合,到,到寄主细,胞,胞染色体DNA上,，,，成为它,的,的一个组,成,成部分。,以噬菌体DNA分,子,子作载体,，,，克隆含,有,有目的基,因,因的外源DNA片,段,段，只要,不,不导致重,要,要的噬菌,体,体基因失,活,活，这种,重,重组的噬,菌,菌体DNA感染了,寄,寄主细胞,之,之后，插,入,入的外源DNA片,段,段便会随,着,着噬菌体DNA分,子,子一道增,殖,殖。可按,照,照类似于,制,制备质粒DNA的,方,方法，分,离,离到大量,的,的重组体,噬,噬菌体DNA，实,现,现克隆基,因,因的扩增,。,。,噬菌体,的,的分子为48.5kb，是,一,一种中等,大,大小的温,和,和噬菌体,。,。迄今已,经,经定位的,噬菌体,基,基因至少,有,有61个,，,，其中有,一,一半左右,参,参与了噬,菌,菌体生命,周,周期的调,控,控（必需,基,基因）;,另,另一部分,基,基因则被,称,称为非必,需,需基因；,当,当它们被,外,外源基因,取,取代之后,，,，不影响,噬,噬菌体的,生,生命周期,。,。由外源,基,基因取代,非,非必需基,因,因所形成,的,的重组噬,菌,菌体DNA，可以,随,随寄主细,胞,胞一起被,复,复制和增,殖,殖。,在噬菌,体,体线性双,链,链DNA,分,分子的两,端,端，各有,一,一条由12个核苷,酸,酸组成的,彼,彼此完全,互,互补的5,单链突,出,出序列（,粘,粘性末端,）,）。当,噬,噬菌体的,线,线性DNA分子注,入,入到被感,染,染寄主细,胞,胞内时，,会,会通过粘,性,性末端之,间,间的互补,作,作用，形,成,成环形双,链,链DNA,分,分子。随,后,后在DNA连接酶,的,的作用下,，,，将相邻,的,的5-P和3-OH,基,基团封闭,起,起来。这,种,种粘性末,端,端结合形,成,成的双链,区,区段称为cos位,点,点cohesive-end site，粘,性,性末端位,点,点)。,野生型的,噬菌体DNA具,有,有太多的,常,常用限制,性,性核酸内,切,切酶切割,位,位点（5,个,个EcoR I,酶,酶切位点,和,和7个Hin d, 酶,切,切位点）,。,。这使它,不,不适于用,作,作基因克,隆,隆的载体,，,，想办法,从,从野生型,噬菌体,基,基因组DNA上消,去,去一些多,余,余的酶切,位,位点并切,除,除非必要,区,区段，将,它,它改造成,适,适用于基,因,因克隆的,载,载体。介,绍,绍改造后,的,的两种类,型,型：,1插入,型,型载体,外,外源DNA克隆,到,到插入型,载体分,子,子上，就,会,会使噬菌,体,体的某种,生,生物功能,丧,丧失效力,，,，即所谓,的,的插入失,活,活效应。,根,根据插入,失,失活效应,的,的特异性,，,，可分为,以,以下两种,亚,亚型。,(1)免,疫,疫功能失,活,活插入型,载,载体：载,体,体的基因,组,组中有一,段,段免疫区,，,，其中带,有,有一两种,限,限制性内,切,切酶的单,切,切割位点,。,。当外源DNA片,段,段插入到,这,这种位点,上,上时，阻,碍,碍其进入,溶,溶源周期,。,。因此，,凡,凡带有外,源,源DNA,插,插人的,重,重组体都,只,只能形成,清,清晰的噬,菌,菌斑，而,没,没有外源DNA插,入,入的亲本,噬,噬菌体就,会,会形成混,浊,浊的噬菌,斑,斑。这种,形,形态学上,的,的差异，,为,为分离重,组,组体分子,提,提供了方,便,便的标志,。,。,(2),-半乳,糖,糖苷酶失,活,活插入型,载,载体：这,种,种载体的,基,基因组中,含,含有大肠,杆,杆菌的lacZ区,段,段，编码,-半乳,糖,糖苷酶。,由,由这种载,体,体感染大,肠,肠杆菌的lac,-,指示菌，,涂,涂布在补,加,加有IPTG和X-gal,的,的培养基,平,平板上，,会,会形成蓝,色,色的噬菌,斑,斑，但在,克,克隆过程,中,中，如果,外,外源DNA插入到lac5,区,区段上，,阻,阻断了-半乳糖,苷,苷酶基因lacZ,的,的编码序,列,列，那么,由,由这种重,组,组体感染,的,的lac,-,指示菌，,由,由于不能,合,合成-,半,半乳糖苷,酶,酶，只能,形,形成无色,的,的噬菌斑,。,。,2替换,型,型载体,又叫作取,代,代型载体,（,（substitution vector)，是在,噬菌体,基,基础上改,建,建的，在,其,其中央部,分,分有一个,可,可以被外,源,源插入DNA分子,所,所取代的DNA片,段,段。当外,源,源DNA,插,插人此类,载,载体时，,一,一对克隆,位,位点之间,的,的DNA,片,片段便会,被,被置换掉,，,，从而有,效,效地提高,了,了克隆外,源,源DNA,片,片段的能,力,力。,在NM781替,换,换型载体,中,中，可取,代,代的Eco RI片段，,编,编码有一,个,个supE基因，,这,这种NM781,噬,噬菌体感,染,染细胞后,，,，其lacZ基因,的,的突变琥,珀,珀被抑制,，,，因此能,在,在X-gal琼脂,培,培养基上,产,产生出蓝,色,色的噬菌,斑,斑。但是,，,，如果这,个,个具有supE基,因,因的Eco RI片段被,外,外源DNA取代了,，,，那么所,形,形成的重,组,组体噬菌,体,体，在上,述,述指示培,养,养基上只,能,能产生出,无,无色的噬,菌,菌斑。,534,柯,柯斯质,粒,粒载体,“Cosmid”,一,一词是由,英,英文“cos site-carringplasmid”,缩,缩写而成,的,的，其原,意,意是指带,有,有粘性末,端,端位点的,质,质粒。柯,斯,斯质粒是,一,一类由人,工,工构建的,含,含有DNA的cos序列,和,和质粒复,制,制子的特,殊,殊类型的,质,质粒载体,。,。,柯斯质粒,载,载体pHC79质,粒,粒兼具了,噬菌体,载,载体和pBR322质粒载,体,体两方面,的,的优点，,其,其克隆能,力,力为31,45kb，而且,能,能够被包,装,装成为具,有,有感染能,力,力的噬菌,体,体颗粒。,柯斯质粒,载,载体的特,点,点,第一，,具,具有,噬,噬菌体,的,的特性,。,。在克,隆,隆了合,适,适长度,的,的外源DNA,，,，并在,体,体外被,包,包装成,噬,噬菌体,颗,颗粒之,后,后，可,以,以高效,转,转染对,噬菌,体,体敏感,的,的大肠,杆,杆菌寄,主,主细胞,。,。进入,寄,寄主细,胞,胞之后,的,的柯斯,质,质粒DNA分,子,子，能,按,按照,噬,噬菌体DNA,同,同样的,方,方式环,化,化。,第二，,具,具有质,粒,粒载体,的,的特性,。,。柯斯,质,质粒载,体,体具有,质,质粒复,制,制子，,因,因此能,像,像质粒DNA,一,一样在,寄,寄主细,胞,胞内进,行,行复制,，,，并且,能,能在氯,霉,霉素作,用,用下，,获,获得进,一,一步扩,增,增。,第三，,具,具有抗,菌,菌素抗,性,性基因,，,，可供,重,重组体,分,分子选,择,择。,第四，,具,具有高,容,容量的,克,克隆能,力,力。柯,斯,斯质粒,载,载体的,分,分子仅,具,具有一,个,个复制,起,起点，,一,一两个,选,选择记,号,号和cos位,点,点等三,个,个组成,部,部分，,其,其分子,较,较小，,一,一般只,有,有57kb,左,左右。,因,因此，,可,可以插,入,入到载,体,体上并,能,能被包,装,装成,噬,噬菌体,颗,颗粒的,最,最大外,源,源DNA片段,，,，克隆,极,极限可,达,达45kb左,右,右。,54,基,基因,的,的分离,与,与鉴定,生命科,学,学各个,研,研究，,“,“克隆,”,”（clone),被,被广泛,使,使用。,通,通常克,隆,隆是无,性,性繁殖,。,。在不,同,同层面,的,的含义,：,：,在多细,胞,胞的高,等,等生物,个,个体水,平,平上，,克,克隆表,示,示由具,有,有相同,基,基因型,的,的同一,物,物种的,两,两个或,数,数个个,体,体组成,的,的群体；从同一,受,受精卵,分,分裂而,来,来的单,卵,卵双生,子,子属于,同,同一克,隆,隆。,在细胞,水,水平上,，,，克隆,是,是指由,同,同一个,祖,祖细胞,分,分裂而,来,来的一,群,群遗传,上,上同一,的,的子细,胞,胞群体。,在分子,生,生物学,上,上，将,外,外源DNA插,入,入具有,复,复制能,力,力的载,体,体DNA中，,使,使之得,以,以永久,保,保存和,复,复制这,种,种过程称为克,隆,隆。,基因克,隆,隆包含,待,待研究,的,的目的,基,基因的,分,分离和,鉴,鉴定两,个,个主要,内,内容，,整,整个过,程,程包括,如,如下4,个,个基本,步,步骤:,(1),用,用于基,因,因克隆,的,的DNA材料,的,的选择,以,以及DNA分,子,子的片,段,段化;,(2),外,外源DNA片,段,段与载,体,体分子,的,的体外,连,连接反,应,应;,(3),将,将人工,重,重组的DNA,分,分子导,人,人它们,能,能够进,行,行正常,复,复制的,寄,寄主细,胞,胞;,(4),重,重组体,分,分子的,转,转化子,克,克隆的,选,选择或,筛,筛选。,54,lDNA,片,片段的,产,产生与,分,分离,从实验,材,材料中,制,制备包,括,括“目,的,的基因,”,”在内,的,的DNA片段,群,群体，,必,必须包,容,容整个,基,基因组,的,的全部,序,序列，DNA,片,片段的,大,大小要,适,适合于,基,基因操,作,作的要,求,求。,鸟枪法(shot-gunapproach)：限,制,制性内,切,切酶消,化,化供体,基,基因组DNA,，,，直接,将,将消化,产,产物与,载,载体分,子,子相连,接,接。重,组,组体分,子,子带有,大,大小不,同,同的插,入,入片段,。,。,真核基,因,因组庞,大,大，载,体,体承受,外,外源DNA插,入,入为1000,3000bp，将,产,产生几,十,十万个,大,大小不,同,同的DNA片,段,段，这,些,些大小,不,不同的DNA,片,片段形,成,成的重,组,组体分,子,子组成,相,相应克,隆,隆群体,。,。要想,从,从如此,巨,巨大的,群,群体中,选,选出带,有,有目的,基,基因的,克,克隆太,费,费事。,局部双酶消,化,化法可以保,证,证DNA产,物,物大小在1030kb左右，通,过,过离心或制,备,备凝胶电泳,技,技术，得到,约,约为20kb的随机群,体,体并将其克,隆,隆到合适的,载,载体上，克,服,服鸟枪法的,困,困难。,542,重,重,组,组体DNA,分,分子的构建,1外源DNA片段定,向,向插入载体,分,分子：,载,载体分子和,待,待克隆的DNA分子都,是,是用同一对(NE1和NE2),切,切割，二者,将,将按一种取,向,向退火形成,重,重组DNA,分,分子，保证,外,外源DNA,片,片段定向插,入,入载体分子,。,。,若载体分子,和,和外源DNA插入片段,不,不能产生出,互,互补的粘性,末,末端，则采,用,用附加衔接,物,物的办法来,提,提高平末端,之,之间的连接,效,效率。,2最佳连,接,接反应,经限制性内,切,切酶切割后,的,的线性载体,分,分子的自身,不,不允许再环,化,化。采用碱,性,性磷酸酯酶,处,处理由内切,酶,酶消化产生,的,的线性载体,分,分子，除去,该,该DNA的5-P末,端,端，而留下,一,一个5-OH基团。,当,当插入了外,源,源DNA片,段,段，其5,为,为-P末端,，,，从而能有,效,效重组。,在连接反应,中,中，使用正,确,确的载体DNA和外源DNA的比,例,例，是获得,高,高产重组转,化,化子的重要,因,因素。,用噬菌体,或,或柯斯质粒,作,作载体时，,配,配制高比值,的,的载体DNA/供体DNA的连接,反,反应体系有,利,利于重组分,子,子的形成。,用质粒作为,克,克隆载体，,其,其重组体分,子,子由一个载,体,体分子和一,个,个供体DNA片段连接,环,环化而成，,当,当载体DNA与供体DNA的比值,为,为1时，有,利,利于这类重,组,组体分子的,形,形成。,3重组体,分,分子导人受,体,体细胞的途,径,径,将外源重组,体,体分子导人,受,受体细胞的,主,主要途径包,括,括转化(或,转,转染)、转,导,导、显微注,射,射和电穿孔,等,等。转化和,转,转导主要适,用,用于细菌一,类,类原核细胞,和,和酵母等低,等,等真核细胞,，,，而显微注,射,射和电穿孔,则,则主要应用,于,于高等动物,的,的真核细胞,。,。在基因工,程,程中有详细,介,介绍。,543cDNA基因,克,克隆,真核生物基,因,因组DNA,大,大，含有大,量,量的重复序,列,列和内含子,，,，难以直接,分,分离到目的,基,基因。通过RT-PCR可以部分,解,解决。,高等生物一,般,般具有35万种左右,不,不同的基因,，,，在一定时,间,间阶段的单,个,个细胞或组,织,织中，仅有15%左右,的,的基因得以,表,表达，产生,出,出约500010000种不同,的,的mRNA,分,分子。,总RNA的,提,提取,rRNA80%85%，tRNA15%20%，mRNA1%5%。,异硫氰酸胍,苯酚Trizolbox.,破,破坏细胞机,构,构，释放RNA，核糖,体,体蛋白与RNA分离，,保,保证RNA,完,完整。氯仿,沉,沉淀蛋白。,异,异丙醇沉淀RNA。乙,醇,醇洗涤RNA。OD,260,为1时，40,g/mL.OD,260,/ OD,280,=1.82.0表示,总,总RNA程,度,度好，低于1.8则有,蛋,蛋白和酚污,染,染。电泳看18S和28S.,cDNA克,隆,隆的基本过,程,程是通过一,系,系列酶催作,用,用，使总poly(A)mRNA,转,转变成双链cDNA群,体,体并插入到,适,适当的载体,分,分子上，转,化,化大肠杆菌,寄,寄主菌株细,胞,胞，构成包,含,含所有基因,编,编码序列的cDNA基,因,因文库。,1高质量mRNA的,制,制备,可应用PromegaPolyAT tract mRNA分离,系,系统分离poly(A)mRNA,。,。将用生物,素,素标识的寡,聚,聚(dT),引,引物与细胞,总,总RNA共,温,温育，加入,与,与微磁球相,连,连的抗生物,素,素蛋白，用,磁,磁场吸附通,过,过寡聚(dT)引物与,抗,抗生物素蛋,白,白及强力微,磁,磁球相连的mRNA。,2反转录,生,生成cDNA,mRNA5,AAAA,互补21-CCC, TTTT-20,21-GGG,所有包含Poly(A)尾巴的mRNA被反,转,转录生成cDNA。,以21和20为引物做PCR：,21,AAAA-20,互补,互补21,20,3、重组体,分,分子的构建,及,及转化寄主,菌,菌株,双链cDNA群体插入,载,载体：,21,AAAA-20,互补,互补21,20,设计21时，让其有,酶,酶1的切点,，,，20有酶2的切,点,点，在质粒,载,载体上有相,应,应的切点，,就,就可以定相,将,将所有PCR片段插入,载,载体。,转化大肠杆,菌,菌寄主菌株,细,细胞，构成,包,包含所有基,因,因编码序列,的,的cDNA,基,基因文库。,载体分子有,抗,抗药性基因,，,，在培养基,中,中加入相应,的,的抗生素进,行,行筛选。,经过特殊处,理,理的具有吸,收,收外源DNA能力的细,菌,菌细胞为感,受,受态细胞。,当重组质粒,分,分子与感受,态,态细胞混合,，,，感受态细,胞,胞数量 ,重,重组质粒分,子,子时，在培,养,养基上长出,的,的单菌落是,由,由一个重组,质,质粒分子导,入,入一个细菌,细,细胞后经过,繁,繁殖而形成,的,的。,在组织和培,养,养的细胞中,，,，一个细胞,中,中有些mRNA可拥有,数,数千个拷贝,，,，而有些mRNA只有,几,几个拷贝。,根,根据mRNA分子含量,的,的多寡，可,以,以将mRNA划分为高,丰,丰度、中丰,度,度和低丰度3种不同的,类,类型。,从表中看出,低,低丰度mRNA，其总,量,量约占总mRNA的30%，约有11000,个,个左右的不,同,同种类的mRNA。如,果,果获得11000个克,隆,隆，得到每,一,一种低丰度mRNA的,可,可能只有30，因此,，,，为了获得,一,一个能够代,表,表全部低丰,度,度mRNA,序,序列的cDNA基因文,库,库，必须的,最,最低克隆数(理论值),应,应是11000/03037000。,由于在实验,中,中存在着取,样,样差异，有,些,些序列容易,被,被克隆，有,些,些序列不容,易,易被克隆，,为,为了保证cDNA文库,中,中能够包含,所,所有的序列,，,，必须增加,克,克隆的数目,。,。为了使低,丰,丰度mRNA的cDNA克隆达到99%的期,望,望率，需要,筛,筛选170000个克,隆,隆。,RACE(rapidamplificationof cDNA)技术,可以扩增缺,失,失的DNA,序,序列。,可以完成3,和5的,未,未知序列的,扩,扩增。,5扩增,3扩增,544,克,克隆基,因,因的分离,1应用核,酸,酸探针分离,克,克隆目的基,因,因: 把cDNA文,库,库转移到尼,龙,龙膜或硝酸,纤,纤维素滤膜,上,上，就可以,与,与特异性的,核,核酸探针进,行,行菌落杂交,，,，以便筛选,出,出具有目的,基,基因的阳性,克,克隆，这个,过,过程叫作克,隆,隆基因的分,离,离或筛选。,应用核酸探,针,针分离目的,基,基因的方法,叫,叫作核酸杂,交,交筛选法。,适,适用于大规,模,模筛选。只,要,要有合适的,现,现成可用的,核,核酸探针，,就,就有可能从,生,生物体的任,何,何组织中分,离,离到目的基,因,因，也就能,够,够有效地检,测,测任何一种,插,插入的外源DNA序列,。,。,分离克隆基,因,因的办法很,多,多，根据不,同,同的需要再,去,去学习具体,的,的方法，这,里,里就不作一,一,一介绍了。,思考题,1、PCR,的,的意思、原,理,理和步骤。,2、已知一,个,个cDNA,的,的3的部,分,分序列，请,设,设计实验流,程,程得到该基,因,因的全长cDNA。,3、叙述,Southern blotting的基本,步,步骤。,4、提取真,核,核生物总RNA的检测,标,标准。,5、简述碱,变,变性法提取,质,质粒DNA,的,的原理及方,法,法。,6、简述凝,胶,胶电泳分离DNA的要,点,点。,