酶活性浓度的测定测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,酶活性浓度的测定测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用,第四节酶活性浓度的测定技术,概述,1.量气法:,此法很少采用,2.分光光度法:,其最大优点在于扩大了测定范围,波长范围更宽。结,合各种工具酶的偶联反应,如应用NAD(P)H和NAD(P)+吸收,光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法,使分光,光度法得到了进一步发展,几乎可应用于各种血清酶活性,的测定。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及,应用,这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。,3.荧光法和放射性核素法:,对于一些酶浓度很低的标本,可考虑改用灵敏度,较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反,应生成荧光物质的速率,此速率与酶浓度成正比,并,通过荧光光度计进行测定,根据荧光强弱的变化换算,出酶的活性。例如,还原型的NAD(P)H有强烈的荧光,故所有以NAD(P)+为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法,进行测定。核素法因有污染且操作烦杂,目前应用较,少。,4.其他方法:,二、酶活性浓度的测定,测定酶的催化活性浓度是临床酶学分,析最为常用的方法,具有迅速、灵敏、成,本低等特点。可根据酶促反应进程曲线,采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。,()酶促反应进程,反应级数,s,时间,图6-2酶促反应时间进程曲绲,(S为底物,P为产物),底物耗尽,吸光度,线性反应期,延滞期,(零级反应期),A,斜率=速度,T,延迟时间一一监测时间一时间,图6-3单试剂测定体系酶促反应进程曲线,(二)酶活性浓度测定方法,酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初,速度()达到最大速度Vmax,即在过量底物存在,下的零级反应期的速度,此时反应速度与酶浓度,E之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓,度测定方法进行分类,可分为定时法( fixed,time assay)和连续监测法( conti nuous,mon i tor ing assay)两大类。,1.定时法,这是早期测定酶活性浓度的方法。,大多是使酶作用一段时间,然后加入强酸、,强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应,测定这段时,间内底物的减少量或产物的生成量,计算酶促反,应平均速度。这类方法有多种命名,如“取样,法”、“终点法”或“两点法”。,用定时法测定酶活性浓度,必,须保证酶和底物在所选定的温度下,作用时间要很精确,否则会引起较,大误差。这种方法的优点是比较简x,单,因测定时酶促反应已被终止,畿,故比色计或分光光度计无需保温设,备,显色剂的选择也可不考虑对酶,活性的影响。缺点是无法知道在整,时间,个酶促反应进程中是否都是零级反图64定时法中可能引起的误差,应,2.连续监测法,连续测定酶反应过程中某一反应,产物或底物的浓度随时间变化的多点,数据,求出酶反应初速度,间接计算,酶活性浓度的方法称为连续监测法。,2.连续监测法,连续测定酶反应过程中某一反应产物或,底物的浓度随时间变化的多点数据,求出酶,反应初速度,间接计算酶活性浓度的方法称,为连续监测法。与定时法不同的是,这类方,法勿需停止酶促反应,不需添加其他呈色试,剂,就可测定反应物的变化,很容易观察到,反应的整个过程,41,、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸收都不可耻。,阿卜,日,法拉兹,42,、只有在人群中间，才能认识自己。,德国,43,、重复别人所说的话，只需要教育；而要挑战别人所说的话，则需要头脑。,玛丽,佩蒂博恩,普尔,44,、卓越的人一大优点是：在不利与艰难的遭遇里百折不饶。,贝多芬,45,、自己的饭量自己知道。,苏联,