基因工程的酶学基础

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,生物技术核心课程,Genetic Engineering,基,因,工,程,基因工程,纲要,第一章,基因工程概论,第二章,基因工程的酶学基础,第三章,基因工程载体概述,第四章,基因工程的主要技术及原理,第五章,目的基因的克隆与分离,第六章,基因的转移与重组体的筛选和鉴定,第七章,克隆基因的表达,第八章,基因工程的应用,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链,DNA,内切酶,核酸酶,：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。,第一节 限制性核酸内切酶,一、基本概念及其生物功能,核酸酶,：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。,第一节 限制性核酸内切酶,一、基本概念及其生物功能,特异水解断裂,RNA,分子，,核糖核酸酶（,RNase,）,，,特异水解断裂,DNA,分子，,脱氧核糖核酸酶（,DNase,）,。,从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫,外切核酸酶,；,从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫,内切核酸酶,按水解断裂核酸分子的方式,:,限制性内切核酸酶,(Restriction endonuclease),是一类能够识别,双链,DNA,分子中的某种,特定核苷酸序列,(4-8bp),，并由此处,切割,DNA,双链,的核酸,内切酶,。,第一节 限制性内切核酸酶,一、基本概念及其生物功能,截至,2007,年,8,月，从各种不同的微生物中分离出了限制性内切酶,3819,种，已经商品化的有,624,种。,2.,性质,主要是从原核生物中分离纯化出来。,内切酶，即在核酸分子链的,内部,制造切口的酶。,帮助细菌限制外来,DNA,的入侵,3.,功能,1.,来源,1,1,两种不同来源的入,-,噬菌体 （ 入,- K,，入,-B,）。,2,能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（,K,株 ，,B,株 ）。,3,当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，,（ 入,K-B,，入,B-K,）感染下降数千倍。,4,一但 入,K,噬菌体在,B,株成功，由,B,株繁殖出,入,-K,后代，能感染,B,株,不能再感染原来,K,株,.,称为：宿主细胞的限制和修饰作用,宿主细胞的限制和修饰作用,限制性内切酶将侵入细菌体内的,外源,DNA,切成小片断。,（,1,）限制（,Restriction,）,细菌自身的,DNA,碱基被,甲基化酶,甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（,2,）修饰（,Modification,）,供质粒扩增的大肠杆菌菌株多数含有两种位点特异性的,DNA,甲基化酶：,G,A,TC,腺嘌呤引入甲基,Dcm,甲基化酶,C,C,AGG,或,C,C,TGG,序列在第二个,C,上引入甲基,Dam,甲基化酶,2.,入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞,K,株，,B,株 中，,1,）宿主细胞甲基化酶，将染色体,DNA,和噬菌体,DNA,特异性保护,.,2,）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。,-,（修饰）,限制和修饰作用的分子机制：,1.,大肠杆菌宿主细胞,K,株，,B,株 ，有各自的限制和修饰系统。,3.,外来,DNA,入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解,-,（限制）,限制和修饰作用的分子机制：,4.,由于降解不完全，外来少数,DNA,分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。,5,接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。,I,型限制性内切酶,目前主要鉴定出,四种不同类型,的限制性内切酶。,二、限制性内切酶的类型,II,型限制性内切酶,III,型限制性内切酶,IV,型限制性内切酶,首先由,M. Meselson,和,R. Yuan,在,1968,年从大肠杆菌,B,株,和,K,株,分离的。,（,1,）识别位点序列,Eco,B,：,TGA*(N),8,TGCT,Eco,K,：,AA*C(N),6,GTGC,1. I,型限制性内切酶,如,Eco,B,和,Eco,K,。,未甲基化修饰的特异序列。,N,：表示任何一种核苷酸,需,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,（,S-,腺苷蛋氨酸）为辅助因子,（,3,）作用机理,在距离特异性识别位点约,1000-1500 bp,处,随机,切割。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（,2,）切割位点,1970,年，,H.O. Smith,和,K.W. Wilcox,首先从流感嗜血,杆菌,d,株中,分离出来。,（,1,）识别位点序列,未甲基化修饰,的,双链,DNA,上的特殊靶序列，多数是回文序列。识别序列长度为,46bp,，少数识别,8bp,（表,2-2,）。,2. II,型限制性内切酶,分离的第一个酶是,Hin,d II,，其次是,Hin,d III,5GAA,TTC3,3CTT,AAG5,特点有二：,回文序列,：,反向重复序列，双链,DNA,中含有两个结构相同，方向相反的序列,1,、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。,2,、这两股,DNA,链若按同方向阅读（如,5,/,3,/,），其核苷酸顺序相同。,5GT,N,AC3,3CA,N,TG5,（,2,）切割位点,切开,双链,DNA,。形成,粘性末端,（,sticky end,）或,平末端,（,blunt end,）。如：,识别位点处。,Eco,R I,5-,G,AATTC,-3,3-,CTTAA,G,-5,产生粘性末端,Eco,R V,5-,GAT,ATC,-3,3-,CTA,TAG,-5,产生平齐末端,DNA,是由四种类型的单核苷酸组成，假定,DNA,的碱基组成是均一的，对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为：,1/4,n,，,n,表示该限制酶识别的碱基数。,识别,4,个碱基的，每,256,（,4,4,）个碱基有一个识别序列,识别,5,个碱基的，每,1024,（,4,5,）个碱基有一个识别序列,识别,6,个碱基的，每,4096,（,4,6,）个碱基有一个识别序列,切割产生的,DNA,片段的理论大小为？,限制性内切酶的切割频率：是指限制性内切核酸酶在,DNA,分子中预测的切点数。,（,2,）切割位点,切开,双链,DNA,。形成,粘性末端,（,sticky end,）或,平末端,（,blunt end,）。如：,识别位点处。,Eco,R I,5-,G,AATTC,-3,3-,CTTAA,G,-5,产生粘性末端,Eco,R V,5-,GAT,ATC,-3,3-,CTA,TAG,-5,产生平齐末端,（,3,）粘性末端（,sticky ends,，,cohensive ends,）,含有几个核苷酸,单链,的末端。,分两种类型：,5,端凸出（如,Eco,R I,切点）,G,AATTC,CTTAA,G,5-,-3,3-,-5,从,5-P,末端切割双链,DNA,的两链，产生,5-P,单链延伸的黏性末端,G,-3,-5,AATTC,G,5-,3-,CTTAA,Eco,R I,等产生的5粘性末端,5 ,G-C-T-,G-A-A-T-T-C,-G-A-G, 3,3 ,C-G-A-,C-T-T-A-A-G,-C-T-C, 5,Eco,R I 37,5 ,G-C-T-,G,-OH,P-,A-A-T-T-C,-G-A-G, 3,3 ,C-G-A-,C-T-T-A-A,-P,OH,-,G,-C-T-C, 5,退火 4-7,5 ,G-C-T-,G A-A-T-T-C,-G-A-G, 3,3 ,C-G-A-,C-T-T-A-A G,-C-T-C, 5,OH,P,OH,P,3,端凸出（如,Pst,I,切点）,CTGCA,G,G,ACGTC,5-,-3,3-,-5,在其识别序列的对称轴两侧，从,3-OH,末端切割双链,DNA,的两条链，产生具有,3-OH,单链延伸的黏性末端。,5-,3-,G,CTGCA,-3,-5,G,ACGTC,Pst,I,等产生的3粘性末端,5 ,G,-,C,-,T,-C-T-G-C-A-G-,G,-,A,-,G 3,3 ,C,-,G,-,A,-G-A-C-G-T-C-,C,-,T,-,C 5,Pst,I 37,5 ,G,-,C,-,T,-C-T-G-C-A,-OH,P,-,G,-,G,-,A,-,G 3,3 ,C,-,G,-,A,-,G,-,P,OH-,A-C-G-T-C,-,C,-,T,-,C 5,退火 4-7,5 ,G,-,C,-,T,-C-T-G-C-A G-,G,-,A,-,G 3,3 ,C,-,G,-,A,-G A-C-G-T-C-C-T-C, 5,OH,P,OH,P, 连接便利,粘性末端的意义,i,）不同的,DNA,双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii,）同一个,DNA,分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成,环形分子,。,这比连接两个平齐末端容易的多。, 补平成平齐末端,5,末端标记,凸出的,5,末端,可用,DNA,多核苷酸激酶进行,32,P,标记。（,5 *p-AATTC-OH 3,）,粘性末端可以用,DNA,聚合酶补平成平齐末端。,（,4,）同裂酶,(Isoschizomers),来源不同，,识别位点的,序列相同,的限制性内切酶。 （原型酶同裂酶）, 完全同裂酶,（同切点酶）,识别位点和切点完全相同,如,Hin,d,和,Hsu,I,。,Hin,d,5-A,AGCTT-3,3-TTCGA,A-5,Hsu,I 5-A,AGCTT-3,3-TTCGA,A-5, 不完全同裂酶（新裂酶） ：,Xma,I 5-C,CCGGG -3,3-GGGCC,C-5,Sma,I 5-CCC,GGG-3,3-GGG,CCC-5,识别位点相同，但切点不同。,如,Xma,I,和,Sma,I,。,（,5,）同尾酶 （,Isocaudamers,）,识别的,序列不同,，但能切出,相同,的粘性末端。如,Bam,H I,、,Bgl,、,Bcl,I,、,Xho,等,5-G,GATC,C-3,3-C,CTAG,G-5,Bam,H I,Bcl,I,5-T,GATC,A-3,3-A,CTAG,T-5,5-A,GATC,T-3,3-T,CTAG,A-5,Bgl,5-R,GATC,Y-3,3-Y,CTAG,R-5,Xho,R,代表嘌呤；,Y,代表嘧啶,5-,GATC,-3,3-,CTAG,-5,Sau,3AI,同尾酶连接后连接处的序列将变得“面目全非”，,一般不能,再被原来的酶识别。,？,5-G,3-C,CTAG,GATC,T,-3,A,-5,Bam,H I,Bgl,5-G,GATC,T,-3,3-C,CTAG,A,-5,Bam,H I,Bgl,Sau,3AI,在离它的,不对称识别位点,一侧的,特定距离,处切割,DNA,双链。,（,6,）,s,型限制性内切酶,移动切割（,s,hifted cleavage):,GACGCNNNNN,Hga,I,CTGCGNNNNNNNNNN,5,3,3. III,型限制性内切酶,有,专一的识别序列,，但不是对称的回文顺序，在识别序列旁边一定数目核苷酸对的位置上切割双链。但这几个核苷酸对的,切割位点不是特异,的。,切割产生的,DNA,片段具有各种单链末端,在基因工程操作中用途不大。,Eco,PI: AGACC,Eco,P15: CAGCAG,4. IV,型限制性内切酶,新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的,DNA,序列。,除,Eco,KMcrBC,外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。,核酸限制性内切酶的类型及主要特性,特性,I,型内切酶,II,型内切酶,III,型内切酶,内切酶的蛋白结构,3,种不同的亚基,单一成分,2,种不同的亚基,限制作用所需要的辅助因子,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,Mg,2+,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,寄主特异性位点识别序列,Eco,B,：,TGA(N),8,TGCT,Eco,K,：,AAC(N),6,GTGC,回文序列，旋转对称,（,IIs,型除外）,Eco,P1:,AGACC,Eco,P15:,CAGCAG,切割位点,在距离识别位点至少,1000 bp,外随机切开一条单链。,位于寄主特异性位点或其附近,识别位点,3,端,24-26bp,处,甲基化作用的位点,寄主特异性位点,寄主特异性位点,寄主特异性位点,识别未甲基化的序列进行切割,能,能,能,序列特异的切割,不是,是,不是,基因工程中的用途,无用,十分有用,用处不大,若载体,DNA,用,M,酶切开，则带有,N,酶黏性末端的外源,DNA,片段中，能直接与载体拼接的是（ ）,M N M N,A,、,A/AGCTT T/TCGAA,B,、,C/CATGG ACATG/G,C,、,GAGCT/C G/AGCTC,D,、,G/GATCC A/GATCT,下列,DNA,片段中含有回文结构的是（ ）,GAAACTGCTTTGAC,GAAACTGGAAACTG,GAAACTGGTCAAAG,GAAACTGCAGTTTC,D,D,1973,年,H.O Smith,和,D. Nathans,提议的命名系统，命名原则如下：,三、限制性内切酶的命名,用,属名,的第一个字母（大写，斜体）和,种名,的头两个字母（小写，斜体）构成酶的基本名称，表示,寄主菌,的物种名。,大肠杆菌（,E,scherichia,co,li,）用,Eco,表示；,流感嗜血菌（,H,aemophilus,in,fluenzae,）用,Hin,表示。,4.,限制酶前面要带上,R,（,R,estriction),， 修饰酶前面要带上,M,（,M,odification,）。（现已省略）。,2.,用一个正体字母表示,菌株或型,。如,Eco,R,、,Hin,d,）。,3.,如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制,-,修复系统，用罗马字母表示。如,Hin,d,I,，,Hi,n,d,II,，,Hin,d,III,。,DNA,中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、,SDS,、,EDTA,、,NaCl,等都会影响酶的活性。,1. DNA,的纯度,四、影响限制性内切酶活性的因素,p18,一般采取,纯化DNA,加大酶的用量 （510,U,酶,/,g,DNA,）,延长保温时间 （34,h,）, 扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释（ 20,l）, 加入亚精胺提高消化作用，需要适当的温度,2. DNA,的甲基化程度,大肠杆菌一般有,两种甲基化酶,修饰质粒：,dam,甲基化酶（修饰,G,A,TC,中的,A,）；,dcm,甲基化酶（修饰,CCA/TGG,的,C,）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。,大多数是,37,，少数例外。,酶,最适,温度,酶,最适,温度,酶,最适,温度,Apa,I,Bcl,I,Mae,II,Taq,I,30,50,50,65,Apy,I,Bst,E II,Mae,III,30,60,55,Ban,I,Mae,I,Sma,I,50,45,25,3.,温度,酶切超螺旋,DNA,分子，所需酶量多于线性,DNA,分子；最高可达,20,倍；,4. DNA,分子的构型,对同一,DNA,分子上不同位置的识别序列，切割效率具有位点偏爱性；,识别序列的侧面序列影响酶切效率。,“保 护 碱 基”,是影响限制酶活性的重要因素。,5.,缓冲液,(Buffer),缓冲液的化学组成：,10Xbuffer,MgCl,2,、,NaCl/KCl,： 提供,Mg,2+,和离子强度；,Tris-HCl,： 维持,pH,；,二硫苏糖醇（,DTT,）：防止酶的氧化，保持酶稳定性；,牛血清白蛋白,BSA,等：提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活 ；,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、,pH,等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。,限制酶的星号活性,当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，称为星号（*）活性。,所以一般使用专一的反应缓冲液。,星号（,*,）活性,Eco,R I,和,Bam,H I,等都有*活性。,Eco,R I,*,在低盐、高,pH,（,8,）时可识别和切割,GAATTA,、,AAATTC,、,GAGTTC,等,GAATTC,Eco,R I,：,使用的时候要特别注意！,概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：,（,1,）高甘油含量（,5, v,v,）；,（,2,） 限制性内切核酸酶用量过高（,100U,ugDNA,）；,（,3,）低离子浓度（,25 mmol,L,）；,（,4,）高,pH,（,8.0,以上）；,（,5,）含有机溶剂，如,DMSO,（二甲基亚砜 ），乙醇等；,（,6,）有非,Mg,2+,的二价阳离子存在（如,Mn,2+,，,Cu,2+,，,Co,2+,，,Zn,2+,等）。,但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（,1g,加,25U,酶）反应较长的时间，才能达到完全酶解。但是不能过分加大酶的用量,酶过量对酶切反应的影响：,1,）酶过量（一般为,100U/gDNA,）会影响识别序列的正确性，如：,Bam,HI,的正常识别序列,: GGATTC,；酶过量识别序列,NGATCN,2,）酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。,6.,酶对消化效率的影响,1U,核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下,1h,，完全水解,1gDNA,所需的酶量,五、限制性内切酶对,DNA,的消化,1.,内切酶与识别序列的结合模式,1986,年,J.A. McClarin,等通过,X,射线晶体衍射发现,II,型限制性内切酶是以,同型二聚体,的形式与靶序列结合。,GAATTC,CTTAAG,两种不同的限制酶切割同一种,DNA,分子,-,构建载体,。,2.,双酶切消化,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用两种酶均适用的缓冲液，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1,倍体积的 5,M NaAc pH 5.4,2.5,倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5,min,、高速冷冻离心10,min,、干燥,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。,低温酶先切，然后升温，加入高温酶再切,内切酶在,DNA,上的,所有,识别位点都被切开。,3.,完全酶切,1,2,3,4,1,2,3,4,只有有限数量的酶切位点被切开。如构建基因组文库。（,p20,）,通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,4.,部分酶切,1,2,3,4,1,4,6.,几种常用限制酶识别位点,37,酶可用,65,温育,5min,高温酶,80,温育,5min,，或用,乙醇,沉淀,DNA,。,5.,限制酶酶切反应的终止,从细菌,DNA,环化现象推测，必定存在一种能把两条,DNA,双链连接到一起的酶。,第二节,DNA,连接酶,一、,DNA,连接酶（,ligase),的发现,1967,年,，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化两条,DNA,的末端之间形成磷酸二酯键的酶，,“,分子黏合剂”。,修复双链,DNA,上切口处的磷酸二酯键（分子间及分子内）,DNA,连接酶,5 ,G,-,C,-,T,-C-T-G-C-A G-,G,-,A,-,G 3,3 ,C,-,G,-,A,-G A-C-G-T-C-,C,-,T,-,C 5,OH,P,OH,P,5 ,G,-,C,-,T,-C-T-G-C-A-G-,G,-,A,-,G 3,3 ,C,-,G,-,A,-G-A-C-G-T-C-,C,-,T,-,C 5,nick,nick,二、,DNA,连接酶的基本性质与特点,（一）,DNA,连接酶的基本性质,修复与,RNA,链结合的,DNA,链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA,连接酶,5 ,G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G, 3,3 ,C,-,G,-,A,-,G,A,-,C,-,G,-,G,-,C,-,C,-,T,-,C 5,OH,P,nick,5 ,G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G, 3,3 ,C,-,G,-,A,-,G,-,A,-,C,-,G,-,G,-,C,-,C,-,T,-,C 5,连接多个平头双链,DNA,分子（分子间及分子内） ：,5 ,G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-C-T-G-G-A-G ,3,3 ,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-G-A-C-C-T-C ,5,5 ,G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,OH,P,-C-T-G-G-A-G ,3,3 ,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,P,OH,-G-A-C-C-T-C ,5,T4-DNA,连接酶,不能催化两条游离的,DNA,单链连接,（,2,）大肠杆菌连接酶,1.,两种,DNA,连接酶,该酶由大肠杆菌基因组中的,lig,基因编码,能连接,粘性末端，平末端,连接效率低。,（二）,DNA ligase,的特点,（,1,）,T4,噬菌体的连接酶,从,T4,噬菌体感染的大肠杆菌中分离的，由,DNA30,编码的产物,不但能连接粘性末端， 还能连接,平末端（,p21,表,2-4,）,。,（,3,）被连接的,DNA,链必须是,双螺旋,的一部分。,（,1,）,DNA 3,端有游离的,-OH,，,5,端有一个磷酸基团（,P,）。,（,2,）需要,能量、,Mg,2+,2. DNA,连接酶催化的连接反应特点,（,4,）只封闭双螺旋,DNA,骨架上的,nick,。,1. ATP,（,NAD,+,）提供激活的,AMP,。,2. ATP,与连接酶形成共价“,连接酶,-AMP,”,（,AMP,与连接酶的,赖氨酸,-,氨基,相连,）复合物，并释放出焦磷酸,PP,i,。,OC-C-CH,2,-CH,2,-CH,2,-CH,2,-NH,2,+,+,H,3,N,AMP,ATP,PP,i,三、连接反应的机理,3.,AMP,随后从连接酶的赖氨酸,-,氨基转移到,DNA,一条链的,5,端,P,上，形成“,DNA-,腺苷酸,”复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,4.,3-OH,对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出,AMP,。,连接酶反应的最佳温度是,37,。,四、影响连接反应的因素,1.,反应温度,37,下,粘性末端,的结合很不稳定，,一般,416,。,平末端,1020,。,2.,连接酶的浓度,在平末端DNA的连接反应中,，,最适的反应酶用量为12U,，,而黏性末端仅为0.1U便能达到连接的最佳效果,。,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,4.,插入片段与载体的浓度比例,p24,外源,DNA,与载体,DNA,的摩尔比：,10 : 1,或更高,当连接温度在,1216,之间时，连接反应时间在,116h,之间；如果温度更低，则延长反应时间。,3.,连接反应的时间,假设连接反应要求载体,:,插入片段的摩尔比为,1:12,，如果连接反应中有,3kb,的载体有,100ng,，应加入,0.5kb,的插入片段多少,ng,？,1/12 = 100ng 0.5kb / 3kb a,插入片段,200ng,?,由限制性内切酶创造的黏性末端的连接属于,分子内部连接,，而平齐末端的连接则属于,分子之间的连接,，因此后者反应速度相对慢得多,如何提高其连接效率呢,?,1,、加大连接酶用量（,10,倍于黏性末端的连接）,2,、加大平齐末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,3,、加入,10%PEG8000,，促进大分子之间的有效作用,4,、加入单价阳离子（,Nacl ),，最终浓度,150200 mM,5,、将平齐末端变成黏性末端,第三节,DNA,聚合酶,基因工程中常用的,DNA,聚合酶,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（全酶）,2.,Klenow,fragment 3. T7 DNA,聚合酶,4. T4 DNA,聚合酶,5.,修饰过的,T7 DNA,聚合酶,6.,Taq,DNA,聚合酶,7.,逆转录酶,DNA,聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续的加到双链,DNA,分子引物链的,3-OH,末端，催化核苷酸的聚合作用。,1.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（全酶）,5,3,聚合,酶活性,3,5,外切酶活性：,主要起校对作用,5,3,外切酶活性：,从,5,端降解,DNA,分子,-OH,5,3,dNTPs,主要用来制备带放射性标记的,DNA,探针。,（,1,）大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（,DNA,Pol,I,）的性质, 底物：,dNTPs,（,dATP,、,dGTP,、,dCTP,、,dTTP,）,Mg,2+, 带有,3-OH,游离端的引物,DNA,模板,（,2,）,DNA,聚合酶,I,（,Pol I,）的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,标记, 核酸探针（,probe,）,能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的特定的,DNA,片段。,已知序列的核酸片断,显示位置,与互补的待测序列杂交,（,3,）用,DNA,聚合酶,I,制备探针,标记,已知序列的核酸片断, 探针的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射性的已知序列的核酸片断,5,3,切口转移法,(nick translation ),：,DNA,聚合酶,I,同时具备,5,3,外切酶,活性和,5,3,的聚合酶,活性（以及,3,5,外切酶活性）。, 探针的标记方式,5,3,外切酶活性从,DNA,切口的,下一段,DNA5,端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的,上一段,DNA,的,3,一侧补上一个新的核苷酸。,切口,切口,5,5,3,3,5,3,5,3,纯化的,DNA,片断,DNase I,制造单链切口,DNA,Pol,I,进行切口转移,一种,32,P-dNTP,和,dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,32,P-dNTP,32,P-dNTP,从头至尾都被标记,2. Klenow fragment,具有,5,3,聚合酶活性和,3,5,外切酶活性。,（,1,）,Klenow fragment,的性质,DNA,Pol,I,Klenow fragment (76KD,）,枯草芽孢杆菌蛋白酶处理，,失去了,5,3,外切酶活性,3,端补平,5,5,klenow,补平限制性内切酶切后形成的,3,隐蔽端，,修复带裂口的,DNA,DNA 3,末端标记,在,3,隐蔽端,加上放射性标记的,dNTP,。,klenow,（,2,）主要用途,3,隐蔽末端的,DNA,片断,Klenow fragment,补平,根据末端的序列选择一种,-,32,P-dNTPs,末端标记的,DNA,限制性内切酶切,5-G3,3-CTTAA5,5-G,AA,3,3-CTTAA5,5-G,AA,TT3,3-CTTAA5,5-G3,3-CCTAG5,5-G,G,3,3-CCTAG5,5-G,G,ATC3,3-CCTAG5,Eco,R I,Bam,H I,-,32,P-dATP,-,32,P-dGTP,25,o,C 1h,cDNA,第二链的合成,mRNA,cDNA,第一链,逆转录,cDNA,第二链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,（,1,）,T4 DNA,聚合酶的性质,3. T4 DNA,聚合酶,从,T4,噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由,噬菌体基因,43,编码。,有,5,3,聚合酶活性,和,3,5,外切酶活性,（降解单链更快）。, 来源, 酶活性, 特点,当没有,dNTP,时，,T4 DNA,聚合酶行使,3,5,外切酶功能，制造出,3,隐蔽端。,如果只有一种,dNTP,，则降解到该,dNTP,的位置。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA,聚合酶,无,dNTPs,T4 DNA,聚合酶,有,dNTPs,5,5,（,2,）,T4 DNA,聚合酶的用途,标记末端（取代合成法）,用,3,5,外切酶活性作用于,所有末端形式的,3,端,（平端、,3,隐蔽端、,5,隐蔽端）制造出,3,隐蔽端。,再利用它的,5,3,聚合酶活性补平，并加入放射性标记的,32,P-dNTP,。标记的,dNTP,逐渐取代被删除掉的原有的核苷酸，因此叫做取代合成。, 补平,3,隐蔽末端, 将双链,DNA,的,3,粘末端转化为平末端,DNA 3,末端标记,具,EcoRI,位点的,DNA,分子,对,DNA,分子,3,端有控制的降解,合成作用产生选择性标记,T4DNA,聚合酶的取代合成法标记,DNA,片段,4. T7 DNA,聚合酶,（,1,）来源,从,T7,噬菌体感染的大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：,T7,基因,5,编码的大亚基：,有,5,3,聚合酶和,3,5,外切酶活性。, 大肠杆菌编码的小亚基：,硫氧还蛋白。,增加大亚基对,模板的亲和性,。,（,2,）,T7 DNA,聚合酶的特点, 持续合成能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成互补链，,合成,DNA,长度大。,3,5,外切酶活性很高,为,Klenow,片段的,1000,倍, 合成不受,DNA,二级结构的影响,其它,DNA,聚合酶受,DNA,二级结构的阻碍, 进行末端标记, 催化大分子模板的,DNA,合成,如,M13, 补平隐蔽末端,（,3,）,T7 DNA,聚合酶的用途,取代合成法标记,3,末端。,与,T4 DNA,聚合酶相同。,合成,补平,3,隐蔽末端；,水解,修平,3,突出末端。,5.,修饰后的,T7 DNA,聚合酶,（,1,）,T7DNA,聚合酶的化学修饰,去除,3,5,外切酶活性，使,DNA,聚合能力和聚合速率提高了,3,倍。,（,2,）修饰后的,T7 DNA,聚合酶的用途, 双脱氧法进行长片段,DNA,测序的理想用酶，“测序酶”,标记,DNA 3,隐蔽末端, 更有效地补平末端,6.,Taq,DNA,聚合酶,最早来源于水生栖热菌,耐热的、依赖,DNA,的,DNA,聚合酶。,（,1,）来源,（,3,）,Taq,DNA,聚合酶的性质,无校正功能，,高保真酶,-,Pfu,DNA,聚合酶,b. PCR,产物可以进行,T-A,克隆,（,2,）应用,PCR,，最适反应温度,75-80,，,150bp / s,7.,反转录酶,最普遍使用的是来源于,禽类成髓细胞瘤病毒,（,a,vian,m,yeloblastosis,v,irus,AMV,）：,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶（,RNA,指导的,DNA,聚合酶）。,（,1,）来源,（,2,）,AMV,的性质,由,和,两条多肽链组成。,RNA,肿瘤病毒。,有反转录活性和,RNaseH,活性。,RNaseH,：,双向外切,DNA-RNA,杂合链中的,RNA,链,反转录酶,3 RNA,5,DNA,3,5,3 RNA,5,DNA,3,5,反转录酶,5,DNA,3,（,3,）逆转录酶的用途, 合成,cDNA,以,oligo dT,为引物（与,mRNA,的,polyA,尾巴互补结合）,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA 5,cDNA, 合成,DNA,探针,用随机引物（,random primer,）或,oligo dT,做引物。,随机引物：,随机顺序形成的寡聚,DNA,片断。,（理论上它能与各种序列的模板结合）,DNA,序列分析,DNA,聚合酶,3,5,5,3,聚合,速率,持续能力,主要作用,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,Klenow fragment,T4DNA,聚合酶,T7DNA,聚合酶,修饰的,T7DNA,聚合酶,逆转录酶,Taq,酶,切口平移,标记,DNA,低,有,中,低,低,低,无,中,中,低,无,高,高,无,快,高,高,快,无,无,无,无,无,有,低,快,中,高,3,端补平,标记,DNA,取代合成法,标记,DNA,同上，催化大分,子,DNA,合成,测序酶,合成,cDNA,PCR,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链,DNA,内切酶,第四节,DNA,修饰酶,一、末端脱氧核苷酸转移酶,（,TdT,）,1. TdT,的基本特性,不需要模板,！, 需要,3-OH,、二甲胂酸缓冲液。,5,3DNA,聚合酶活性,（逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性,DNA,分子,3-OH,末端）, 随机添加的,dNTPs,。,如果只有一种,dNTP,，就添加上,同聚物,。,不需要模板的,DNA,聚合酶，,随机掺入,dNTPs, 底物可以是：单链,DNA,3-OH,突出的双链,DNA,平末端,在,Co,2+,代替,Mg,2+,下也可以,DNA 5,3,TTT,dTTP,，末端转移酶,2.,末端转移酶的用途,（,1,）同聚物加尾克隆,DNA,片段,给,外源,DNA,片断,和,载体,分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。,外源,DNA,载体,DNA,5,3,5,3,CCC,CCC,GGG,GGG,dGTP,dCTP,末端转移酶,（,2,）再生酶切位点,便于回收克隆片断。,A,AGCT,T,T,TCGA,A,5,5,Hin,d,酶切,A,TTCGA,AGCTT,A,Klenow,补平,AAGCT,TTCGA,AGCTT,TCGAA,AAGCA,TTT,TTCGA,AGCTT,TTT,TCGAA,末端转移酶,AAA,AAA,外源,DNA,（,3,）标记,DNA,片断的,3,端,AAGCT,TTT,TTCGA,AGCTT,TTT,TCGAA,AAA,AAA,Hin,d,位点,Hin,d,位点,连接,具有放射性同位素,32,P,的,dNTP,、,ddNTP,为底物,非放射性标记物：生物素,-11-dUTP,等,二、,T4,多核苷酸激酶,1.,来源,T4,噬菌体的,pseT,基因编码。,从,T4,感染大肠杆菌细胞中分离出来。,多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。,2.,功能,催化,磷酸从,ATP,转给双链或单链,DNA,、,RNA,的,5-OH,端。使已脱磷酸化的,5,末端重新磷酸化。,3.,多核苷酸激酶的用途,催化,5-OH,末端磷酸化，便于,DNA,分子连接；,标记,DNA,或,RNA,的,5,端,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32,P-,-OH,5,3,HO-,-,32,P,5,(,-,32,P,)ATP,多核苷酸激酶,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,碱性磷酸酶,（,1,）正向反应（,forward reaction,）,（,2,）交换反应,（,exchange reaction,）,反应混合物中具有,超量,ADP,和,(,-,32,P)ATP,时，多核苷酸激酶能催化,(,-,32,P,)ATP,的,-,32,P,与,DNA5,端的磷酸,交换,。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,3,32,P,-,-OH,5,3,HO-,-,32,P,5,(,-,32,P,)ATP,、,ADP,多核苷酸激酶,效率低于正向反应，反应效果不理想,三、碱性磷酸酶,1.,碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离，具有抗热性,B,acterial,a,lkaline,p,hosphatase,，,BAP,（,1,）细菌性碱性磷酸酶,（,2,）小牛肠碱性磷酸酶,C,alf,i,ntestinal alkaline,p,hosphatase,，,CIP,从小牛肠中纯化，比,活性,比,BAP,高,1020,倍,加热,70,，10min,可完全失活,2.,碱性磷酸酶的特性,催化脱掉,DNA,（或,RNA,）,5,端的磷酸基团,。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,碱性磷酸酶,3.,碱性磷酸酶的功能,（,1,）去除,DNA,或,RNA,分子的,5,末端磷酸基团，防止线性化的载体分子自我连接,单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。,AAGCTT,TTCGAA,Hin,d,酶切,A-OH,T,TCGA,-,P,P,-,AGCT,T,HO-A,碱性磷酸酶,5,5,5,A-OH,TTCGA-,OH,HO,-AGCTT,HO-A,OH,与,OH,不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。,酶切后的,外源,DNA,的,5,端有,P,，能与脱磷酸的载体,OH,连接,3,P-,AGCTT,A,-OH,5,3,HO-,A,TTCGA,-P,5,外源,DNA,A,TTCGA,AGCTT,A,AGCTT,A,A,TTCGA,连接酶,-OH,与,-OH,连不住,其中每条链上都有一个,nick,，但转入细菌后会被修复,3,P-,AGCTT,A,-OH,5,3,HO-,A,TTCGA,-P,5,外源,DNA,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32,P-,-OH,5,3,HO-,-,32,P,5,(,-,32,P,)ATP,多核苷酸激酶,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,碱性磷酸酶,（,2,）与多核苷酸激酶共同作用，标记,DNA5,末端,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链,DNA,内切酶,第五节 核酸外切酶（,Exonucleases,）,从多核苷酸链的末端开始逐个,降解,核苷酸,一、单链,DNA,外切酶,1.,大肠杆菌核酸外切酶,I,（,exo,I,）,5,3,外切,识别,5-OH,2.,大肠杆菌核酸外切酶,（,exo,）,5,3,、,3,5,外切,产生短的,225bp,的寡核苷酸片段,识别,3-OH,、,5-P,二、双链,DNA,外切酶,1.,核酸外切酶,（,exo,）,3,5,外切,识别,3-OH,主要用途：,在,DNA,双链的末端产生出单链区域。,5,5,5,5,exo,与,Klenow,配合进行,3,端标记,-OH,HO-,2.,核酸外切酶（,exo,）,5,3,外切。,主要用途：,使,DNA,双链变成单链,5 P-,-P 5,5,5,exo,成为测序模板。,识别,5-P,（但不能降解,5-OH,）,3. T7,基因,6,外切核酸酶,5,3,外切。,用途与,exo,一样，但,活性较低,用于,5,端有控制的匀速降解,既能识别,5-P,，又能识别,5-OH,。,5,5,5,5,DNA,外切酶,切割方式,识别位点,单链,大肠杆菌外切核酸酶,I,（,exo,I,）,大肠杆菌外切核酸酶,（,exo,）,双链,外切核酸酶,（,exo,）,外切核酸酶（,exo,）,T7,基因,6,外切核酸酶,5,3,5-OH,5,3,3,5,5-P,3-OH,3-OH,3,5,5,3,5,3,5-P,5-P,5-OH,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链,DNA,内切酶,（,1,）内切单链,DNA,或,RNA,，催化其降解,S1,5,dNMPs,或 5,rNMPs,第六节 单链内切核酸酶,一、,S1,核酸酶, 低水平,Zn,2+,，, pH4.04.3,1,、,S1,核酸内切酶的功能,高度单链特异性,（,2,）切掉双链核酸中的单链区,S1,S1,双链分子中的单链区：发卡结构或有缺口的部位。,Zn,2+,Zn,2+,（,4,）不能降解双链,DNA,或,RNA-DNA,杂交链,不能识别单个碱基对的错配,ATGCAT GCATGC,TACGTA CGTACG,T,甚至能识别单个核苷酸的单链区！,（,3,）降解限制酶切形成的单链突出端。,5,dNMPs,或 5,NMPs,ssDNA or RNA,二、,Bal 31,核酸酶,1.,功能,既有,单链,特异的,DNA,（,RNA,）内切酶功能；,又有,双链,特异的,DNA,外切酶功能。,降解双链,DNA,或其上的单链缺口、未配对的单链区域。,3. Bal31,的用途,定位测定,DNA,片断中的限制酶位点分布。,Eco,R I,Eco,R I,Bam,H I,Hin,d III,EGTA,（乙二醇双四乙酸）专一性螯合,Ca,2+,，可终止反应。,2.,反应条件,Mg,2+,、,Ca,2+,与对照组（不用,Bal,31,消化）只用相同的酶切的电泳比较。,根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原,DNA,中的位置。,用,Bal,31,消化线性,DNA,，并在,不同的时间,加入,EGTA,终止反应，再酶切电泳。,Bal31,控制消化法：,Eco,R I,Eco,R I,Bam,H I,Hin,d III,Eco,R I,Eco,R I,Bam,H I,Hin,d III,Bal,31,Hin,d III,Eco,R I,Bam,H I,Marker,Hin,d III,Eco,R I,Bam,H I,Marker,对照,DNA,载体经,Hin,d,切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源,DNA,的连接效率，常用的防止载体自连的方法有,和,。,切口平移是指在,的作用下，使,带上放射性标记。,在酶切缓冲液中，一般需加入,BSA,，请问加入,BSA,的作用是,。,下列哪一种酶作用时需要引物（ ）,A,、末端转移酶,B,、反转录酶,C,、,DNA,连接酶,D,、限制酶,下列,DNA,片段，最可能含有,SstI,酶切位点的是（ ）,GGAGAGCTCT,GAGCACATCT,CCCTGTGGGA,ATCCTACATG,AACCTTGGAA,若将含有 5 末端 4 碱基突出的外源 DNA 片段插入到含有 3 末端 4 碱基突出的载体质粒上，又必须保证连接区域的碱基对数目既不增加也不减少，则需用的工具酶是,（ ）,I. T 4 -DNA 聚合酶,II. Klenow,III. T 4 -DNA 连接酶,IV. 碱性磷酸,酶, III, II + III, I + II + III, I + II + III + IV,思考题,DNA,连接酶的作用特点有哪些？,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。,何谓,Star activity,？简述,Star activity,的影响因素及克服方法？,举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有的重要用途,