玉米芽尖转化研究

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Company Logo,玉米芽尖转化研究和GFP基因的转化,上海大学,生命科学学院,报告人：孙臣成,概述：,Company Logo,玉米是世界上第三大粮食作物,种植面积仅次于水稻和小麦。中国是世界上第二大玉米生产国。玉米不仅是重要的粮食,而且还是重要的饲料作物,在国民经济中占有非常重要的地位。因此，玉米的遗传转化一直受到极大的关注。,在玉米的遗传转化中常见的受体包括愈伤组织、原生质体、种质、直接分化四种。其中种质受体指转基因利用的受体是植物自身的生殖系统，如花粉粒、卵细胞，也称生殖细胞受体系统，主要从两个途径利用种质受体进行基因转化；直接分化指叶片、幼茎等外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织而直接分化出不定芽获得再生植株。,本次试验采用玉米芽尖作为转化受体，该转化受体在国内外很少见有报道，在国内处于先进水平，与其他受体相比具有操作简单、转化周期较短等优点。,Company Logo,报告基因是研究真核,(,原核,),生物中外源基因表达，调控，转染等非常有效的工具。本实验采用的是,GPF,报告基因，,GFP,源于多管水母，不需加入任何底物或辅酶，即可在流式细胞仪任、共聚焦扫描激光显微镜、荧光比色仪、荧光显微镜等下检测到绿色荧光。与传统的报告基因相比，,GFP,的突出优点是对细胞无伤害和便于对活细胞测定。,转化总流程,种子消毒,切取幼芽并侵染,共培养,筛选,分化,生根,切根,二次生根,转化过程-1：种子消毒与萌发,1.3,消毒过和种子种植在,MS,（,pH=5.8,）上，,26,暗培养,2-3,天。,1.2,玉米籽粒用酒精和升汞各灭菌,10min,，用无菌水洗涤,5,次,1.1,挑选健康饱满的种子，发芽率在,90%,以上。,转化过程-2：切取芽尖,选取发芽势强的种子，切取芽尖约2毫米，不宜超过4毫米。,胚芽,切点,胚根,转化的关键步骤！操作员对切点位置的掌握与转化成功率直接相关。,注：切芽尖时注意保湿。,转化过程-3：侵染,3.1,培养农杆菌,(OD600=0.8-1.2),3.2,菌液离心（,6000 rpm,，,10 min,）,用等体积浸染液重浮。,3.3,将外植体放在重浮液中，,26,，,130,转,/,分钟，慢速共培养,3,小时。,转化过程-4：共培养,Company Logo,用无菌滤纸滤干，移植到共培养基上，,26,，暗培养,3,天。,转化过程-4：筛选培养,在加有20mg/L 潮霉素 250mg/L 羧苄青霉素的筛选培养基上26暗培养7 天。,注：每皿放置芽尖不可多放，否则容易褐化。,转化过程-5：分化培养,在分化培养基上3-4轮（7天/轮）,光周期（16/8小时）,光强120-50,m,mol/sm,2,温度25,注：每次继代时及时剔除褐化芽，并切除芽下褐化部分。,转化过程-6：生根,6.1 当抗性苗长到3 cm米移到生根培养基上。,6.2 切除下部褐化组织。,注：切根为关键步骤，不可切过！生出的根要及时观察是否有根毛，对于无吸收能力的根要及时切除，重新生根。,转化过程-6：生根,难点,:,由于时间的原因，并未继续继代。最近一次观察时，玉米苗还未长出具有吸收能力的根，不能进行后续的移苗，除草剂筛选等过程，又因为此时的幼苗可能稍有农杆菌残留，亦不适合进行,PCR,的检测，及荧光蛋白的观察。,本实验尝试新的玉米转化体系的构建，但由于一些步骤还处于摸索阶段，某些处理存在缺陷，导致出现了玉米苗生根困难的情况。,分析可能的原因，排除玉米本身除了部分自交系以外大部分自交系都具有胚性愈伤组织的诱导、继代和分化再生更为困难的特点，也有可能是生根培养基的成分并不适合这个转化体系。可以尝试增加培养基中钙离子浓度等方法。,Company Logo,THD END!,Thank you!,