岛津液相色谱仪教材

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,岛津液相色谱仪基础知识,岛津企业管理（中国）有限公司,分析仪器事业部 分析中心,岛津,HPLC,的历史,Started in 1969,1969,1972,1978,1981,1982,1984,1991,1997,2000,2004,2010,2010,GPC,系统开发,LC-1,（,LC-830,）销售,LC-3A,系列销售,LC-4A,系列销售,LC-5A,系列销售,LC-6A,系列销售,LC-10A,系列销售,LC-VP,系列销售,LC-2010,销售,LC-20A Prominence,销售,LC-15C,销售,LC-30A Nexera,销售,与,DuPont,签订许可合同后制造销售,CDQR,方式的单柱塞型送液单元为特征,内置微型计算机的全自动,HPLC,世界上首创的微量型,LC,对应,HPLC,世界上最早的积木型,HPLC,、现在的,HPLC,的前身,世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器,采用有效性支持功能的积木型,HPLC,追求性能和操作性更加完善的一体型,HPLC,为分析实验室带来革新的,HPLC,为了让,LC,分析更为便捷,130MPa,耐压系统，低系统容量，高温分析和样品自动前处理,在售产品,岛津,HPLC,的历史,2000,1997,THECNLOGY,BREAKTHROUGH,Flexible HPLC System with,Micro-stroke Volume Solvent,Delivery Unit,THECNLOGY,BREAKTHROUGH,LC-2010,LC-VP,2008,2004,THECNLOGY,BREAKTHROUGH,THECNLOGY,BREAKTHROUGH,2010,THECNLOGY,BREAKTHROUGH,2010,THECNLOGY,BREAKTHROUGH,LC-20A,Prominence,UFLC,Prominence,LC-15C,Essentia,UHPLC LC-30A,Nexera,LC-20A Prominence,基础知识讲解内容,1,、色谱基础知识,2,、硬件基础知识,3,、定量基础知识,4,、维护基础知识,第一部分,色谱基础知识,色谱起源,石油醚,色谱,色素混合物,碳酸钙颗粒,分离组分,色谱发展史,20,世纪初，俄国植物学家,M.S. Tswett,提出经典液相色谱法；,20-30,年代，柱分配色谱和纸色谱；,50,年代，气相色谱，薄层色谱；,60,年代，凝胶渗透色谱及高效液相色谱；,70,年代，高效毛细管气相色谱法；,80,年代，电色谱；,90,年代，光色谱。,色谱定义,色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术,流动相：携带样品流过整个系统的流体,固定相：静止不动的一相，色谱柱,色谱是一种分离技术,色谱的主要目的是对混合物中的目标物,分离和定量,Ethyl Paraben,Propyl Paraben,Methyl Paraben,Butyl Paraben,2.5,3.0,mV,500,400,300,200,100,0,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,min,色谱分类,高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography (HPLC),气相色谱,Gas Chromatography (GC),薄层色谱,Thin-Layer Chromatography (TLC),毛细管电泳,Capillary Electrophoresis (CE),HPLC vs GC,液相色谱：,以液体作为流动相的色谱分离方法,适用于高沸点、大分子、强极性,和热稳定性差的化合物的分析,流动相具有运载样品分子和选择,性分离的双重作用,气相色谱：,以气体作为流动相的色谱分离方法,适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子,化合物的分析,流动相只起运载样品分子的能力,HPLC,简易流程图,输液泵,进样器,柱温箱,检测器,色谱柱,储液瓶,数据处理系统,HPLC,特点,分离性能好,-9,10,-12,g,）灵敏度高（,10,选择性高（同分异构，旋光异构）,分析速度快,进样量小（,1-100,L,）,HPLC,分类,反相色谱（,reversed phase chromatography,）,离子对色谱（,ion-pair chromatography,）,正相色谱（,normal phase chromatography,）,离子交换色谱（,ion exchange chromatography,）,尺寸排阻色谱（,GPC / GFC,）,反相色谱,流动相的极性大于固定相的极性,C,18,(ODS),C,8,(octyl),C,4,(butyl),苯基,TMS,氰基,非极性,-O-Si(CH,3,),2,-C,18,H,37,SiO,2,相互作用力是什么,疏水性,OH,C,18,(ODS),SiO,2,强,OH,弱,疏水性,如果样品有,CH,3,CH,2,CH,2,碳链,作用力强,芳香基,如果样品有,COOH,羧基,NH,2,氨基,OH,羟基,作用力弱,反相色谱流动相的选择,优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要,甲醇、乙腈和,THF,是常用的有机溶剂。,在有缓冲液的情况下，缓冲液的浓度和,pH,值,非常重要。,流动相极性变化对分离的影响,20 %,水,30 %,水,40%,水,1:,2:,3:,4:,对羟基苯甲酸甲酯,对羟基苯甲酸乙酯,对羟基苯甲酸丙酯,对羟基苯甲酸丁酯,有机相,:,甲醇,固定相极性变化对分离的影响,C,8,SiO,2,C,18,(ODS),一般,样品,SiO,2,强,样品,C,4,SiO,2,弱,样品,固定相极性变化对分离的影响,ODS,C,8,TMS,分析条件,柱,: Shim-pack CLC-ODS,流动相,: MeOH : H,2,O = 7:3,流速,: 1.0 mL/min,温度,: 40,进样体积,: 10,L,检测器,: UV-254 nm,色谱峰,1.,苯甲酸甲酯,2.,苯甲酸乙酯,3. n-,苯甲酸丙酯,4. n-,苯甲酸丁酯,反相离子对色谱,原理,固定相,流动相,样品离子与流动相中离子对试剂的反离子生成疏水,性离子对，而为反相色谱固定相保留。,疏水性的苯乙烯,/,二乙烯基苯树脂或键合的硅胶,水（缓冲液）,+,离子对试剂,+,有机溶剂,所带电荷与待测离子相反,离子对试剂,常用离子对试剂,阴离子化合物,氢氧化四丁基铵,溴化四丁基铵,阳离子化合物,丁烷基磺酸钠,戊烷基磺酸钠,己烷基磺酸钠,庚烷基磺酸钠,辛烷基磺酸钠,癸烷基磺酸钠,十二烷基磺酸钠,（,C4,）,（,C5,）,（,C6,）,（,C7,）,（,C8,）,（,C10,）,（,SDS,）,反相离子对色谱流动相的选择,离子对试剂的类型,所带电荷与待测物质相反,离子对试剂的浓度,10,-4,10,-2,mol/L,在一定范围内，浓度越大，被分离物的保留值越大。,流动相的,pH,反相离子对色谱应用,有机酸、碱、盐的分离,包括,阴阳离子表面活性剂,大分子脂肪酸,烷基磺酸盐和芳香硫酸盐,含氮化合物,生物碱,水溶性维生素,酚类,正相色谱,流动相的极性小于固定相的极性,硅 胶 柱,:,氰 基 柱,:,氨 基 柱,:,二醇基柱,:,常用,常用,分析糖,分析蛋白质,-Si-CH,2,CH,2,CH,2,CN,SiO,2,SiO,2,硅胶,-Si-CH,2,CH,2,CH,2,NH,2,-Si-CH,2,CH,2,CH,2,OCH,(OH),-CH,2,(OH),化学键合相,相互作用力是什么,强,SiOH,SiOH,弱,非常弱,OH,HO,氢键力,氢键力,如果样品有,COOH,羧基,NH,2,氨基,OH,羟基,氢键力强,如果样品没有任何官能团，如碳水化合物,如果样品有大的基团,由于空间位阻,氢键力弱,正相模式下流动相的选择,主要试剂,烷烃 （戊烷、己烷、庚烷、辛烷）,芳香烃 （苯、甲苯、二甲苯）,二氯甲烷,氯仿,四氯化碳,辅助试剂,甲基,-t-,丁基醚,(MTBE),，乙醚，四氢呋喃,(THF),，二氧杂,环乙烷， 嘧啶，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，异丙醇，乙醇，,甲醇,为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂,。,流动相极性变化对分离的影响,0 %,甲醇,2 %,甲醇,5%,甲醇,1:,2:,3:,4:,邻苯二甲酸二辛酯,邻苯二甲酸二丁酯,邻苯二甲酸二乙酯,邻苯二甲酸二甲酯,主要试剂,:,己烷,反相色谱与正相色谱的对比,反相色谱,流动相极性大于固定相极性,适用于能溶于水,/,有机混合物的中性或非离子化合物分离,正相色谱,流动相极性小于固定相极性,适用于不溶于水,/,有机混合液的亲脂样品、异构体混,合物的分离和制备,HPLC,反相色谱与正相色谱的对比,反相,保留时间重现性好,固定相耐用,正相,对立体异构体有很好的分离（,Vitamin E,等）,保留时间重现性稍差,离子交换色谱,原理：利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差,异来实现分离,固定相：离子交换树脂,流动相：水缓冲溶液（常用）或有机溶剂与水缓冲溶液的混,合液,离子交换色谱所用的缓冲液：,阴离子分离：氢氧化物、硼酸盐、碳酸盐、酚盐和两性离子等,阳离子分离：矿物酸，如硝酸、盐酸、硫酸和甲基磺酸等,离子交换色谱作用力,离子吸引力,样品,+,+,+,样品,+,+ + +,R,+,RN,R,-,SO,3,离子交换色谱应用,生物领域（蛋白质、农药、氨基酸分析）,离子分,阳离子交换剂,-,）,强阳离子交换剂（,SCX,）（,R-SO,3,-,）,弱阳离子交换剂（,WCX,）（,R-COO,阴离子交换剂,+,）,强阴离子交换剂 （,SAX,）,（,R,4,N,弱阴离子交换剂 （,WAX,）（,DEAE,）,尺寸排阻色谱法,(SEC),原理：利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的,一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色,谱方法。,固定相：一种表面惰性、具有一定孔径的多孔凝胶,应用： 聚合物及生命科学领域,SEC,分类,凝胶渗透色谱 （,GPC,）,主要用于聚合物领域,以有机溶剂为流动相（氯仿，,THF,，,DMF,）,常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物,凝胶过滤色谱 （,GFC,）,主要用于生命科学领域,以水溶液为流动相,常用固定相填料：亲水性有机凝胶（葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰,胺等）,GPC,分离原理,固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔径内部,样品与固定相之间无作用力,保留时间不同,样品,大,填充物颗粒,中,小,孔穴,GPC,分离原理,排阻极限,Log (MW),渗透极限,V,第二部分,硬件基础知识,HPLC,简易流程图,脱气机,色谱柱,进样器,输液泵,储液瓶,柱温箱,数据处理系统,检测器,储液瓶,由机械性能和化学稳定性好的不锈钢、玻璃或聚,四氟乙烯材料制成,使用过程中储液瓶应适当密闭,所有溶剂应先过滤，再装入储液瓶,溶剂前处理,-,过滤,过滤：,0.45,m,或更小孔径滤膜,目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞,色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液,滤膜类型：,聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。,醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水,基溶剂。,尼龙,66,滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶,液，可以用于强酸，不适用于,DMF,，,THF,，,CHCl,3,等溶剂。,再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样,品和有机溶剂。,溶剂前处理,-,脱气,脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡,气泡对测定的影响：,1,）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积,2,）柱中气泡使流动相绕流，峰变形,3,）检测器中的气泡产生基线波动,常用脱气方法,超声脱气,减压脱气,在线脱气,脱气机,-,在线真空脱气,组成：,脱气机主要由脱气管、真空室和,真空泵组成。,脱气管,真空室,到泵,真空室内的脱气管由特殊的,透析材料制成，当溶剂流经脱气,管时，溶解在溶剂中的气体穿过,管壁被脱出。,储液瓶,输液泵,性能要求,能在高压下连续工作,输出流量范围宽,输出流量稳定、精确度、重复性高,47,岛津输液泵系列,目的,单元,LC-20AT,LC-15C,流速范围,0.001-10ml/min,特性和应用,非凡的耐用性，适于常量,分析,极低脉动，适于半微量,LC,和,LC-MS,分析,极低脉动，适于半微量,LC,和,LC-MS,分析,分析,LC-20AD,LC-30A,LC-20AB,0.0001-10ml/min,0.0001-5ml/min,0.0001-10ml/min,LC-20AT,选配件,支架,压力传感器,泵头固定座,泵头,辅助进口单向阀,主进口单向阀,LC-20AT,主泵头,副泵头,串联式柱塞往复泵,单向阀,LC-20AD,选配件支架,出口单向阀,压力传感器,泵头,泵头固,定座,进液口,泵头,LC-20AD,进口单向阀,泵头,单向阀,并联式微体积柱塞往复泵,LC-20AB,压力传感器,连接块,出口单向阀,泵头,泵头固定座,进口单向阀,泵,B,LC-20AB,进液口,泵,A,柱塞往复泵结构示意图,单向阀工作原理,单向阀结构,单向阀工作原理,吸液冲程,宝石球,抛光面,泵头,球座,进口单向阀,出口单向阀,排液冲程,洗脱系统组成,等度洗脱系统,梯度洗脱系统,高压梯度洗脱系统,低压梯度洗脱系统,等度,B%,B%,梯度,时间,时间,使用梯度洗脱的原因,当采用等度洗脱时：,MeOH / H2O = 6 / 4,分析时间长,分离度差,MeOH / H2O = 8 / 2,( column : ODS ),使用梯度洗脱的原因,当采用梯度洗脱时：,95%,甲,醇,浓,度,30%,在最短时间内获得最佳的分离,梯度洗脱要点,梯度洗脱：,优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度,注意事项：,溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差,梯度混合的溶剂互溶性要好,梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫,外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏,感的通用型检测器（如示差折光检测器）,查看空白实验的数据,遵守分析周期（最初的分析数据不采用）,等度洗脱,输液泵,进样器,柱温箱,检测器,色谱柱,单一或混合溶剂,高压梯度系统,A,泵,B,混合器,泵,进样器,分析柱,柱温箱,检测器,数据处理系统,C,泵,梯度准确率高,需要,2-3,个泵,可以不配在线脱气机,低压梯度系统,混合器,分析柱,进样器,输液泵,低压梯度比例阀,检测器,柱温箱,数据处理系统,脱气机,一台泵最多可使用,4,种流动相,泵前预混合,需带在线脱气机,A,B,C,D,流动相的选择,采用“,HPLC”,级溶剂,避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂,对试样有适宜的溶解度,溶剂粘度要小,与检测器相匹配,水的等级,水的等级,纯化水,蒸馏水,去离子水,吸,光,率,去离子水,纯化水,波长,(nm),因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,水的等级,HPLC,用水可以通过以下几个方法得到：,专门的纯水机或超纯水机：理想的,HPLC,用水应为,18.2 M,的超纯水，,并通过,0.22,m,的滤膜，除去热源、有机物、 无机离子及空气等,去离子水重蒸,二次或三次重蒸水,不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水,水的等级,未注入样品时空白梯度的色谱图,水中不纯物的出峰,水中的不纯物保留在柱中，随之被乙腈洗脱,有机溶剂的等级,有机溶剂的等级,HPLC,级,优级纯,分析纯,微量分析、梯度洗脱,都经过蒸馏和,0.45,m,的过滤（除纤维毛,未溶解的机械颗粒）,优级纯的纯度比分析纯大，但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC,级经过,0.2,m,的过滤，且除去有紫外吸收的杂质,有机溶剂的等级,分析纯级和,HPLC,级溶剂的吸光度比较图,甲醇,乙腈,正己烷,选择缓冲液的步骤,1.,确定最佳分离状态时的流动相,pH,2.,选择具有与流动相的,pH,相近的,pKa,的缓冲液,（即使浓度稀也具有较强的缓冲能力）,3.,确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收,（在波长,210nm,附近进行检测时，不能用醋 酸和柠檬酸的缓冲液）,常用代表性的弱酸的,pKa,值,pK1,醋酸,柠檬酸,磷酸,4.87,3.13,2.16,pK2,pK3,4.76,7.21,6.40,12.32,缓冲液的使用,使用前必须过滤,使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、,阻塞： 用纯水冲洗,30-60 min(1 ml/min),，再用甲,醇冲洗,30 min,。,易受到细菌和霉菌的影响,不能直接用有机溶剂,冲洗缓冲盐溶液,进样器,手动进样器,自动进样器,要求：,无残留,扩散小,进样体积可变,可承受高压,手动进样器的原理图,装填状态,泵,进样状态,泵,6,1,2,6,1,2,5,4,3,5,4,柱子,3,柱子,1,6,5,1,6,5,4,4,进样量和检测器响应的关系示意图,检,测,器,响,应,值,全量注入,部分注入,定量环体积的一半,3,倍定量环体积,进样体积,部分注入和全量注入,部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如,20,L,的定量环最多进样,10,L,的样品，并且要求每次进样体积,准确、相同。,全量注入：进样量最少为定量环体积的,3,至,5,倍，即,20,L,的定,量环最少进样,60,至,100,L,的样品，这样才能完全置换样品定量,环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。,交叉污染产生的原因,红色表示残留样品,手动进样方法,一般的方法,1.,在进样状态下清洗针口,2.,在装填状态下插入微量注射器,3.,注入样品,4.,切到进样状态,手动进样方法,便捷的方法（不需清洗）,1.,进样状态下插入微量注射器,2.,切到装填状态,3.,注入样品,4.,切回到进样状态,自动进样器,由计算机自动控,制定量阀，按预先编,制注射样品的操作程,序工作。,自动进样器,清洗,(Rinse),：进样针移动到清洗口，针的外壁被清洗,液清洗的过程。,排气,(Purge),：排除管路中的气泡和更换旧流动相的 过,程。,色谱柱,常用色谱柱,反相,C,18,(ODS),、,C,8,、,C,4,、苯基、,TMS,、 氰基,正相,硅胶、氰基 、氨基、二醇基,离子交换色谱,阳离子交换剂,强阳离子交换剂,(SCX),弱阳离子交换剂,(WCX),阴离子交换剂,强阴离子交换剂,(SAX),弱阴离子交换剂,(WAX),R-SO,3-,R-COO,-,NR,4+,DEAE,体积排阻色谱,苯乙烯二乙烯基苯共聚物、葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺,分离模式的选择,反相色谱：第一选择,反相离子对色谱,/,正相色谱：第二选择,特殊：,高分子量化合物：聚合物、 蛋白或糖类,无机离子,光学异构体,色谱柱的选择,10,5,分子量,10,4,非水相,体积排阻,离子交换,离子对反相,反相,10,3,水相正相,非极性,中等极性,高极性,色谱柱的连接,死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题,色谱柱,公螺母,死体积,管线,好的连接,差的连接,色谱柱的使用,新色谱柱使用前：,最好用强溶剂在低流量下,(0.2-0.3 ml/min),冲洗,30 min,，长时间未用的分析柱也要同样处理,新色谱柱先测柱效，并保留色谱图和实验条件,定期检测柱效,色谱柱的使用,1.,流动相：高纯度，过滤,pH,范围,有机溶剂与色谱柱匹配互溶、并能溶解,样品,2.,净化样品,3.,使用保护柱：与色谱柱填料、内径一致,避免色谱柱污染,色谱柱的使用,4.,分离条件,流速、柱温、梯度的变化幅度,5.,定期使用强溶剂冲洗柱子,6.,使用缓冲盐后，要先用含,10%,甲醇的水溶液冲洗，,再用有机溶剂冲洗,7.,流动相正相反相转换时用异丙醇过渡,色谱柱的存放,存放前充分冲洗,合适的存放溶剂,接好堵头，避免固定相干涸,存放环境,柱温箱,分析结果重现性好,提高柱效,降低柱压,保证检测稳定性,柱温箱,CTO-20A/AC,空气强制循环式,CTO-15C,模块加热式,CTO-30A,CTO-10AS,液相色谱检测器的选择,样品的性质,分离目的不同，对检测的要求不同,定量：高选择性、高灵敏度,定性或制备：通用性,常用检测器,紫外可见光检测器,(UV),二极管阵列检测器,(PDA),荧光检测器,(RF),示差折光检测器,(RID),电导检测器,(CDD),蒸发光散射检测器,(ELSD),质谱检测器,(LCMS),紫外可见光检测器,样品池,C :,浓度,E,in,l,E,out,朗伯,-,比耳定律,A=,Cl,= - log (E,out,/ Ein),(A :,吸光度,),紫外可见光检测器,样品池,光栅,E,in,E,out,光电二极管,E,in,E,in,参比池,光电二极管,D2 / W,光源,紫外可见光检测器,紫外检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择,性吸收。,定量基础：朗伯,-,比耳定律，,A,CL,优点：,1,）,灵敏度高,2,）,对温度和流速不敏感,3,）,可用于梯度洗脱,缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,双波长检测,日本饮用水标准（,2004,年,4,月起实施 ）,1.,磺草灵（,asulam,）,2.,甲基硫菌灵（,thiophanate-methyl,）,3.,环草隆,1,（,siduron,）,4.,环草隆,2,（,siduron,）,5.,依普同（,iprodione,）,分析条件：,色谱柱：,Shim-pack VP-ODS (150,mmL. 4.6 mmI.D.),流动相：,Acetonitrile/ 50 mM,KH,2,PO,4,(pH3.0) =55/45(v/v%),流速：,1.0 mL/min,柱温,: 40C,检测,: 230 nm, 270 nm,进样,: 10 L,饮用水中,4,种农药残留双波长分析,波长切换,波长扫描,紫外检测器,启动仪器或开灯后，需要一定的时间使基线稳定,检查流通池与管路有无漏液,检测时，请关闭前面板,清洗流通池，防止堵塞,标准流通池：,12 L,，耐压,12 MPa,（半微量流通池：,2.5 L,）,氘灯：,2000,小时，不要频繁的开关（,3,小时）,二极管阵列检测器,二极管阵列检测器,样品池,光栅,D2 / W,灯,每一组分可在每一波,长处得到一吸光度值,二极管阵列,二极管阵列检测器,光谱,色谱,吸光度,波,长,时间,二极管阵列检测器,二极管阵列检测器,采集三维谱图，可以发现单波长检测时未,检测到的峰,光谱定性，谱库搜索,峰纯度检验,二极管阵列检测器,启动仪器或开灯后，需要一定的时间使基线稳定,检查流通池与管路有无漏液,检测时，请关闭前面板,清洗流通池，防止堵塞,标准流通池：,10 L,，耐压,12 MPa,（半微量流通池：,2.5 L,）,氘灯：,2000,小时，不要频繁的开关（,3,小时）,荧光检测器,激发波长,+ h,1,*,*,A,*,h,1,A,h,2,h,2+,发射波长,荧光,荧光检测器,氙灯,光电倍增管,光栅,样品池,荧光检测器,荧光检测器,原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测,优点：,1,）灵敏度高，是最灵敏的检测器之一,2,）选择性好,3,）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱,缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质或能经过衍生化,反应产生荧光的物质,可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、卟啉、儿茶酚氨等（具,有对称共轭体系）或氨基酸、脂肪酸等需衍生后检测样品,荧光检测器,启动仪器或开灯后，需要一定的时间使基线稳定,检查流通池与管路有无漏液,检测时，请关闭前面板,清洗流通池，防止堵塞,o,C,时，,温度上升，荧光强度下降（常温附近温度变化超过,1,有些化合物强度变化达到,5%,）,标准流通池：,12 L,，耐压,2 MPa,氙灯：,2000,小时,(RF-20AxL),，不要频繁的开关,荧光检测器应用,氨基酸检测,OPA,衍生,CHO,A,A,N-R,+ R-NH,2,CHO,o-phthalaldhyde,(OPA),脂肪酸检测,ADAM,衍生,+ R-COOH,CHN,2,9-anthryldiazomethane,(ADAM),CH,2,OCOR,氨基酸检测,OPA,柱后衍生,Taurine,mV,700,检测器,A:Ex:350nm,Em:450nm,600,500,400,300,Asp,200,100,0,0.0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,40.0,45.0,50.0,55.0,60.0min,Thr,Ser,Gly,Met,isoLeu,Leu,Tyr,Phe,His,Lys,Ammonia,Glu,Pro,各组分浓度：,0.02,mol/mL,，进样,10 L,Cys,Val,Arg,Ala,示差折光检测器,光学系统,钨灯,准直镜,狭缝,物镜,狭缝,反射镜,调零透镜,硅光电池,样品池,示差折光检测器,示差折光检测器,示差折光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中,各组分浓度。,优点：通用型检测器,缺点：,1,）对温度变化敏感,2,）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测,3,）属于中等灵敏度的检测器,示差折光检测器,检测时，请关闭前面板,清洗流通池，防止堵塞,流通池：,9 L,，耐压,2 MPa,进口：,63.5 L,出口：,280.2 L,钨灯：,20000,小时,糖分析例,分析条件,色谱柱,: Shim-pack CLC-NH,2,流动相,:,乙腈,/,水,= 7 / 3,流速,: 1.0 mL/min,温度,:,室温,峰,1.,甘油,2.,木糖,3.,果糖,4.,葡萄糖,5.,蔗糖,6.,甘露糖,7.,乳糖,电导检测器,V,I,K,(,电导,),= I A / E V,2, / L cm x k=A cm,(k :,电导率,),k= (I/E)x(L/A),A,A,电极,L,电极,电导检测器,原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导率的变化来,测定电离物质含量，广泛应用于离子色谱法。,优点：对流动相流速和压力的改变不敏感,缺点：对温度变化敏感,（温度每升高,1,，电导率增加,2 %-2.5 %),用途：主要用于离子色谱，检测无机和有机离子,电导检测器,清洗流通池，防止堵塞,流通池：,0.25 L,，耐压,2.9 MPa,海水中阴离子分析例,分析条件,色谱柱,: Shim-pack IC-A3,流动相,: 8.0 mM p-hydroxybenzoic acid,3.2 mM Bis-Tris,流速,: 1.5 mL/min,温度,: 40,进样体积,: 100 L,色谱峰,1. F,-,2. Cl,-,3. NO,2-,4. Br,-,5. NO,3-,6. SO,4 2-,(1.4 ppm),(10200 ppm),(10 ppm),(43 ppm),(44 ppm),(431 ppm),阳离子分析例,+,+,+,+,2+,2+,分析条件,色谱柱,: Shim-pack IC-C1,流动相,: 5 nM,硝酸溶液,流速,: 1.5 mL/min,温度,: 40,o,C,进样：,50 L,蒸发光散射检测器,流动相,雾化,载气,雾化器,蒸发,光电倍增管,检测池,检测,光源,光电倍增管,漂移管,LED,蒸发光散射检测器,原理,:,流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴，溶剂挥发,后，溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统，进入散射室,中，检验散射光的强度。,优点,:,消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移，可梯度,洗脱，灵敏度高，是,HPLC,的通用型检测器。,缺点： 不能使用非挥发性缓冲盐做流动相，如磷酸盐。,蒸发光散射检测器,废气不能直接排放在室内,如果流动相中含有机溶剂，使用惰性气体做雾化气,避免使用在工作温度下能引起爆炸的溶剂和雾化气,流动相中不使用非挥发性盐,雾化气压力不要超过,450 kPa,先开气，后开泵,保证雾化器虹吸出口充满液体,不要打开前门,LED,灯：,5000,小时,PEG-1000,分析例,质谱检测器,强大的定性和选择性能力,多组份样品的准确定性,未充分分离组份峰的鉴别,消除杂质干扰,可作为便捷的定性分析,用于合成和衍生反应的研究,作,NMR,预分析的质谱鉴定,人造色素质谱图,(x1,000,000),8.0,7.0,6.0,1,2 3,4,5,6,8,9,7,10,11,12,5.0,4.0,3.0,2.0,1.0,0.0,0.0,TIC,m/z,467,m/z,537,m/z,421,m/z,407,m/z,451,m/z,763,m/z,747,m/z,557,m/z,784.5,m/z,834.5,m/z,972.5,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,min,色谱柱,:,流动相,:,时间程序,:,流速,:,进样体积,:,柱温,:,Shim-pack XR-ODS (50 mmL x,2.0 mmI.D. Particle size: 2.2 m),A; 20mmol/L NH4Ac (pH 4.7),B; 20mmol/L NH4Ac (pH 4.7),/A CN=1/1,10%B (0 min) - 100%B (5.0 min),0.5 mL/min,5 L,40 C,扫描范围,m/z,200-1200,1: tartrazine,2: amaranth,3: indigo carmine,4: new coccine,5: sunset yellow FCF,6: allura red AC,7: fast green FCF,8: brilliant blue FCF,9: acid red,10: phloxine B,11: erythrosine,12: rose bengal,第三部分,定量基础知识,定性方法,色谱峰的定性鉴别,通过保留值,(,通常是保留时间,),进行定性,需要指定保留时间误差范围（时间窗、时间带）,在相同的分析条件下,保留时间相同并不肯定是同样的组份,保留时间不同肯定不是同样的组份,定性确证,仅仅通过保留时间并不能完全确证该物质,通过加入标准物确认,通过改变色谱条件确认,光谱和质谱信息也可以作为进一步确证手段,其他仪器方法确证,定量分析的基本要求,需要有纯物质作标准,被定量组分峰要与其它峰达到基线分离,符合定性参数要求,选择合适的定量方法,定量分析基本公式,在某些条件限定下，被测组分的浓度与检测器的响应值成正比的关系。,（蒸发光散射检测器浓度与峰面积不成线性，分别取对数后成线性 ）,C,i,= f,i,A,i,C,i,= f,i,H,i,C,i,：,f,i,:,A,i,：,H,i,：,组分浓度,响应因子，与组分的物理化学性质和检测器的性质有关,组分响应面积,组分响应高度,实际修饰公式：,Y=aX+b,常用定量方法,面积归一化,外标法,内标法,标准加入法,面积归一化法,不能作为准确定量的方法，仅在特定情况下使用,公式,特点：,Ai,Ci,% = 100 %,Ai,1,、无需做校正，简便，快速,2,、进样量不严格要求,3,、要求所有组分都流出并且被检测到,4,、要求所有组分的响应因子相当,外标法,浓度,C,1,A,2,C,2,面积,A,1,A,4,A,3,A,2,A,1,A,4,C,4,C,1,C,2,C,3,浓度,C,4,峰面积,标准曲线,A,3,C,3,外标法,C,i,=,f,i,A,i,fii,组分工作曲线的斜率,实验室最常用的定量方法，定量结果准确,特点：,1,、不需所有峰都流出或被检测到，只对目标组分作校正,2,、需要标准样品,3,、进样量必须准确,4,、仪器必须有良好的稳定性,单点校正法,当被测试样中各组分浓度变化范围不大时，可不必绘制多点的标准,曲线，而用单点校正法（比较法）。配制一个和被测组分含量接近的标,准溶液，定量进样，根据被测组分和外标组分峰面积比或峰高比计算被,测组分的含量。,w,i,A,i,=,w,s,A,s,当方法存在较大的系统误差,单点校正法的误差较大。,内标法,浓度,目标 内标,C,1,C,IS,A,2,A,IS,C,2,C,IS,A,3,A,IS,C,3,C,IS,A,4,A,IS,C,4,C,IS,C,1,/C,IS,C,2,/C,IS,C,3,/C,IS,C,4,/C,IS,浓度比,:,目标,/,内标,面积,A,1,A,IS,A,4,/A,IS,A,3,/A,IS,A,2,/A,IS,A,1,/A,IS,面积比,:,目标,/,内标,标准曲线,内标法,试样配制：准确称取一定量的试样,Wi,，加入一定量内标物,W,S,计算公式：,w,i,=,f,i,A,i,w,s,=,f,s,A,s,f,i,A,i,A,i,w,i,=,w,s,=,f,i,w,s,f,s,A,s,A,s,f,i,为待测组分,(i),对内标物,(s),的质量相对校正因,子,内标法特点,多用在国际标准和规定比较严格的方法中,特点：,1,、进样量不严格要求,2,、只对所测组分作校正,3,、必须在样品中加一内标组分,4,、操作较为繁琐,5,、选择内标物比较困难,选择内标物应注意,1,、理化性质与待测物相近,2,、在样品中不存在且不与样品中组分发生化学反应,3,、内标物与待测物响应相近,4,、与待测物有良好的分离，但又不能相距太远,5,、与待测物的峰面积比为,0.7-1.3,最好，因此要根据待测物,的 浓度确定内标物的添加量,标准加入法,当难以选择合适的内标物或无空白样品时，以欲测组分的纯物,质为内标物加入到待测样品中，然后在相同的色谱条件下，测定加,入欲测组分前后的峰面积，从而计算待测组分的含量。,w,i,=,f,i,A,i,w,i,+,w,i,=,f,i,A,i,w,i,+,w,i,A,i,=,w,i,A,i,f,i,=,f,i,w,i,w,i,=,A,i,1,A,i,标准加入法特点,1,、不需另外选择内标物,2,、进样量不必十分准确，操作简单,3,、两次色谱条件完全相同以保证校正因,子完全相等,定量计算常用术语,Integration parameters,：,积分参数，规定计算出峰面积的方法,Identification,：,定性参数，保留时间及允许误差,Quantification method,：,定量方法，选择定量方法,(,外标法,内标法等,),Curve fit Type,：,Compound table,：,曲线拟合类型，包括线性、二次方程等,化合物表，定义要进行定量计算的组分，其中,包括定性和定量参数,1) Type,：,组分类型，指组分的分析类别,Target,：,要计算的目标组分,ISTD,：,指该组分为添加的内标组分,Reference,：,指该组分为参比组分，用来对目标组分进行确认,ISTD&Ref.,：,指该组分既是内标组分，又是参比组分,2) Conc,：,浓度，指目标组分的计算结果,定量计算常用术语,Sample Type,：,样品类型，规定该数据的计算类别,Standard,：,标样， 浓度已知的标准品，用来制作标准曲线,Unknown,：,未知样，浓度待测的目标组分,Sample Amt,.,：,样品量,待测样品的原始称样量,在计算结果中会除以该数值,Dil. Factor,：,稀释因子,待测样品的稀释倍数，在计算结果中会乘以该数值,ISTD Amt,.,：,内标量，内标组分的添加量,Level,：,样品浓度水平，规定数据的浓度级别，,Unknown,为,0,，,Standard,为整数，浓度由低到高依次为,1,、,2,、,3,、,4,、,5,Peak Table,：,峰表，所有积分结果的列表,数据处理参数,积分参数：（,Width, Slope, Drift, T.DBL,等）,定性参数：保留时间及允许误差（时间窗，时间带）,定量参数：,1),定量方法：外标法、内标法、面积归一法等,2),曲线点数：一点或多点,3),曲线拟合：线性、折线、曲线,积分参数,积分参数,基本积分参数,Channel,：,通道，指定检测器检测信号的通道,Width,：,半峰宽，峰的半高宽，排除峰宽小于最小峰宽的峰,Slope,：,斜率，用来判断出峰起点、终点以及滤除低平噪声,Drift,：,漂移，判断相邻峰的积分方式,设定值为,0,时，积分仪将自动判断,如,Drift,与基线至峰谷连线较接近时，积分面积值可能变化较,大,T.DBL,：,时间变参，根据时间自动改变峰宽和斜率,Minimum area,：,最小峰面积，排除面积小于该值的峰,Slope,的设定,Slope,Slope,Slope,峰斜率，作为噪声滤除,Slope,Slope,峰斜率，积分不稳定，须手动设,定,Drift,值的,设定,(,手动校正,),Drift,Drift,Drift,Drift,Drift,Drift,注：,1),设定值为,0,时，积分仪将自动判断,2),如,Drift,与基线至峰谷连线较接近时，积分面积值可能变化较大,Drift,值的设定,(,自动校正,),谷宽,半峰高宽度,T2,半峰高宽度,T2T1,.DBL,的设定,T.DBL,：时间变参，根据时间自动改变峰宽和斜率,等度洗脱时，出峰时间越长，峰越宽,设定值为,0,时，根据宽度自动判断,默认值为,1000,，此时该参数不起作用,在实际使用中，一般使用默认设定,积分,锁定,Integration Off to On,：锁定某一时间范围的峰，使之不计算积分,mAU (x10),2.5 202nm4nm (1.00),2.0,1.5,1.0,0.5,0.0,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,min,Integration Off to On,定性参数,定性参数,绝对保留时间,相对保留时间,保留时间允许误差,时间窗：相对允差,一般设为,5%,时间带：绝对允差,一般设为,0.050.25 min,定量参数,定量参数,定量方法：,面积归一法、外标法、内标法等,工作曲线的制作：,曲线点数：一点、两点及多点,曲线计算：线性、折线、二次曲线、三次曲线,影响定量结果的因素,保留时间的重现性（对,GPC,影响很大）,样品问题（杂质、溶剂、稳定性、配制）,进样问题（准确度和精密度）,检测器的性能（影响线性、检出限、灵敏度）,方法的可靠性,积分参数的设定,第四部分,维护基础知识,日常维护,目的：维持仪器处于正常运作状态，有效的降低仪器发生故障的,频率，延长仪器的使用寿命。,准备工作：,使用,&,维护日志,设备的耗材和备件,维护工具盒,试剂（甲醇、异丙醇、稀硝酸等）,超声波清洗机,液相系统维护流程图,线路过滤器,单向阀,色谱柱,柱塞密封圈,进样器,检测器,吸滤头,输液系统日常维护部件,排液阀,清洗流路密封圈,柱塞,保险丝,柱塞密封圈,吸滤头,主进口单向阀,线路过滤器,辅助进口单向阀,管线选择,材料,不锈钢,特氟隆,(Teflon),聚醚醚酮,(PEEK),尺寸,不锈钢材质管路,0.1 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.3 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.5 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.8 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.13 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.25 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,PEEK,材质管路,管线材料,不锈钢,(,可用于所有连接,),能承受几百,MPa,压力,酸性或高浓度盐环境中易腐蚀,(,尤其在,pH,小于,2,时,),PEEK (,可用于所有连接,),能承受高达,25 MPa,压力,可在整个,pH,范围,(pH 1-14),内使用,不适用高溶解性溶剂如三氯甲烷、四氢呋喃等,Teflon,(,用于柱后阻尼管、反应管和排液管,),化学惰性大,仅能承受,0.5 MPa,压力,管线材料,使用高溶解性溶剂如氯仿、,THF,等,当,ID.0.25 mm,或,0.13 mm,、氯仿、,THF 25 %,以下，,10 MPa,以下的使用,条件时，在实际应用中一般没有问题。,特氟隆材质管路,作为废液管的时候，请勿随意增长或缩短其长度。增长管路，会提高,背压，有损坏检测器的危险；缩短管路，容易使得检测器内产生气泡,。,接头,不锈钢接头,/,垫圈,主要用于输液泵、进样器的管路连接,能承受,40 MPa,以上的压力,一旦固定，垫圈不可再动,垫圈,不锈钢接头,PEEK,接头,主要用于色谱柱、检测器的管路连接,易于安装,能承受,25 MPa,的压力,容易产生死体积,PEEK,接头,死体积,产生原因：由于管路连接不好产生的额外体积,死体积可能会引起分离度下降和重现性变差等问题,色谱柱,公螺母,死体积,管线,好的连接,差的连接,吸滤头,材料：不锈钢烧结,(,或陶瓷），孔径,10,m,功能：防止较大固体不溶物进入液相色谱,系统,日常维护：定期使用异丙醇（或,5,稀硝酸）,清洗,故障：吸滤头堵塞,现象：管路中不断有气泡生成,措施：用异丙醇（或,5,稀硝酸）浸泡并进行超声波浴清洗，再用蒸,馏水清洗至中性,LC-20AT,选配件支,架,压力传感器,泵头固定座,泵头,辅助进口单向阀,主进口单向阀,LC-20AT,LC-20AD,选配件支架,出口单向阀,压力传感器,泵头,泵头固定座,进口单向阀,进液口,LC-20AD,单向阀结构,注意：,请不要分解阀心,A,和阀心,B,重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定,单向阀故障处理,故障：宝石球或球座受污导致密封不好,表现：系统压力波动大,措施：,1,）打开排液阀，用泵输送或用注射针打入异丙醇进行清洗,2,）拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波浴清洗,注意：超声波清洗时开口端向上放置。,单向阀故障处理,故障：宝石球粘附于垫片,表现：泵无法吸液或排液，流路不通,措施：,1,）用针筒抽出口单向阀，利用产生的负压使宝石球,与垫片分开。,2,）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波浴清洗。,柱塞密封圈,柱塞密封圈,LC-20AD,LC-20AB,LC-10ADvp,部件号,228-35146,取下和安装,柱塞密封圈工具,柱塞密封圈,LC-20AT,LC-10ATvp,部件号：,228-35145,柱塞密封圈故障处理,密封圈,故障：密封圈磨损导致密封不良,现象：系统压力波动大或漏液,措施：更换密封圈,注意：,拆卸泵头前，必须将柱塞杆复位,（仪器面板上的,P-SET,界面）,柱塞杆,泵头清洗管路,流动相,线路过滤器,排液阀,压力传感器,故障：堵塞,现象：系统压力偏高,判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，,设定流速,1mL/min,，如压力,0.3 MPa,，,可以判定为线路过滤器堵塞。,措施：以异丙醇,(,或,5,稀硝酸,),为清洗剂，超声波浴清洗。,再用水洗至中性。,线路过滤器,流动相,过滤器的更换,如果清洗无法解决故障，需要更换线路过滤器。,旧过滤器的取出,新过滤器的安装,新型号线路过滤器,部件号：,228-35871-99,混合器,混合器不同体积的连接方法,混合器故障处理,常见故障：堵塞,混