临床检测-谷丙转氨酶活性的测定

*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,血清,丙氨酸氨基转移酶活性,测定（改良赖氏法）,三峡大学医学院生物化学教研室,临床指标的检测,1.掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本原理。,2.熟悉血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的具体操作方法。,3.了解血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的临床意义。,【目的要求】,临床意义,谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic Transaminase，,GPT,),丙氨酸氨基转移酶(Alanine Transaminase，ALT),ALT(GPT)广泛存在于机体各种组织中，但在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是,急性肝炎及肝细胞坏死,，血清中谷丙转氨酶活性显著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此酶活性也可中度或轻度增高。,如何测定酶的活性?,活性单位定义中必须规定哪些条件?,在紫外分光光度计中，,1ml,血清(反应溶液总量为3ml)在,340nm,波长下，用内径为,1.0cm,的比色皿，在,25,，1分钟内生成的,丙酮酸,，在乳酸氢酶催化下，使NADH+H,+,变成NAD,+,，使光密度下降0.001为1个转氨酶活性单位。,卡门氏单位的定义为：,丙氨酸+-酮戊二酸,谷氨酸+丙酮酸,GPT,乳酸氢酶,NAD,+,+乳酸,NADH+H,+,丙氨酸+-酮戊二酸,谷氨酸+丙酮酸,GPT,乳酸氢酶,NAD,+,+乳酸,NADH+H,+,改良赖氏法,显色反应,分光光度法,赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用卡门氏单位作表示的。,血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：,【实验原理】,0,1,2,3,4,5,丙酮酸标准液(ml),0.00,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,ALT底物试剂(ml),0.50,0.45,0.40,0.35,0.30,0.25,0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4(ml),0.10,0.10,0.10,0.10,0.10,0.10,相当于GPT活性(卡门氏单位),0.00,28,57,97,150,200,37水浴预温5分钟，各管加,2,4-二硝基苯肼,0.5ml混匀，再在37水浴中放置20分钟后，各管加0.4mol/L,NaOH,溶液5ml，混匀放置10分钟后，以蒸馏水调零点，用520nm波长比色，读取各管光密。.,各管的读数均减去对照管(O管)的光密度，然后以光密度值为纵坐标，各管相应的转氨酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。,实验操作,1.标准曲线的制作:,T,C,血 清(ml),0.1,ALT底物液(ml),0.5,0.5,混匀后，置37水浴中保温30分钟,2，4-二硝基苯肼液(ml),0.5,0.5,混匀后，置37水浴中保温30分钟,血 清(ml),0.1,0.4mol/L NaOH(ml),5.0,5.0,2.酶活性测定：,测定前将底物缓冲液在37水浴中预温5分钟，再按下表操作。,混匀，在室温中放置10分钟，以蒸馏水调零点，用520nm波长比色，读取光密度。用T-C管的光密度查标准曲线，即得到待测血清中所含ALT的酶活性。,参考值：,525卡门氏单位,【临床意义】,肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。,【思考题】,1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？,2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？,