《多酚氧化酶》PPT课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,多酚氧化酶,一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布,二、多酚氧化酶催化反应及其作用底物,三、,pH,和温度对多酚氧化酶活力影响,四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂和果蔬酶促褐变的防止,五、多酚氧化酶的分子形式,六、多酚氧化酶活力测定,七、水果和蔬菜中的多酚氧化酶及其底物,思考题：简述酶促褐变的机理及其控制措施。,一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布,多酚氧化酶,(1,2-,苯二酚,:,氧 氧化还原酶,EC 1.10.3.1),一类含铜的,氧化还原酶,，催化邻,-,苯二酚氧化成邻,-,苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物。,多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：,单酚氧化酶,(,酪氨酸酶,tyrosinase,EC.1.14.18.1),、,双酚氧化酶,(,儿茶酚氧化酶,catechol oxidse,EC.1.10.3.2),和,漆酶,(,对苯二酚氧化酶,laccase,EC.1.10.3.1),。,在这三大类多酚氧化酶中，,儿茶酚酶主要分布在植物中,，,微生物,中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。,1,、多酚氧化酶的名称,2,、植物中多酚氧化酶分布,多酚氧化酶是植物中最受注意的一种酶,在葡萄,洋李,无花果,枣,茶叶和咖啡豆中含量很高,它在这些果实中起着人们,期望,的作用,.,多酚氧化酶在桃,苹果,香蕉,荔枝,马铃薯,莲藕和莴苣中的含量也是相当高,然而它对这些果实起着,不需宜,的作用,易引起,褐变,造成,变质,和,腐烂,对于新鲜果实的,保藏带来极大困难,胡椒中不存在多酚氧化酶,.,存在,:,植物、果蔬的叶绿体、线粒体,马铃薯块茎分布广泛,多酚氧化酶在植物中的含量随,品种,不同而有很大变化，在众多的水果和蔬菜中，,橄榄中的多酚氧化酶活力最高,。,多酚氧化酶的活力分布还取决于果蔬的,成熟度,。在绿叶中，很大一部分酶活力集中在叶绿体中，在马铃薯块茎中，几乎集中在亚细胞中；在新采收的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。,果蔬中不同的,部位,的多酚氧化酶含量差别很大，例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。,二、多酚氧化酶催化反应 及其作用底物,1.,催化反应,多酚氧化酶是一种加氧酶，它催化酚的选择性,羟基化,，羟基化产物继续,氧化,生成,邻,-,苯醌,。,多酚氧化酶的作用下氧化形成不稳定的,邻,-,苯醌类,化合物,然后再进一步通过非酶氧化反应,聚合成,黑色素,(melanin,melnn),。,邻,-,苯醌,多酚氧化酶的作用,导致香蕉,苹果,桃,马铃薯,蘑菇,虾发生,非需宜,的褐变和人的黑斑形成,然而对茶叶,咖啡,葡萄干和梅干,以及人的皮肤色素形成产生,需宜,的褐变,当邻苯醌与蛋白质中,赖氨酸,残基的,-,氨基,反应,可引起蛋白质的,营养价值,和,溶解度,下降,同样由于褐变反应也将会造成食品的,质地,和,风味,的变化。,热带水果,50%,以上的损失都是由于,酶促褐变,引起的,.,同时酶促褐变也是造成,新鲜蔬菜,例如莴苣和果汁的颜色变化,营养和口感变劣的主要原因,控制,果蔬加工和贮藏过程中,酶促褐变,例如,驱除,O,2,和底物酚类化合物,以防止褐变,或者添加抗坏血酸,亚硫酸氢钠和硫醇类化合物等,将初始产物,邻苯醌还原为原来的底物,从而阻止黑色素的生成,.,还原剂,都能直接引起,酶失活,从而抑制酶促褐变,.,这是因为抗坏血酸能够破坏酶活性位点上的组氨酸残基,而亚硫酸氢钠和硫醇可以除去酶活性位点中的,Cu,2+,4-,己基间苯二酚,苯甲酸,和其他一些,非底物酚类化合物,也可作为多酚氧化酶的有效,竞争性抑制剂,2.,作用底物,水果、蔬菜中底物为：,一元酚类,邻二酚类（对位二酚也可）,（间位二酚不作底物）,如：,水果中的儿茶酚,OH,OH,土豆中的酪氨酸,HO CH,2,CHCOOH,NH,2,重要的天然底物,三、,pH,和温度对多酚氧化酶,活力影响,1.pH,对酶活力的影响,(1),适宜,pH,：,4,7,(2),不同种类，甚至同一种果蔬中的不同品种得到的多酚氧化酶，也有不同的最适,pH,(3),果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶,最适,pH,也有差异,(4),酶的提取或分离的方法对它的最适,pH,也有影响,(5),测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最适,pH,也有影响,(6),大多数多酚氧化酶只有一个最适,pH,在一些情况下,有第二个最适,pH,2.,温度对多酚氧化酶活力影响,不同种类、品种、部位的,多酚氧化酶有不同的热稳定性，,通常最适温度在常温,加热易使酶失活,同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同的热稳定性,低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，但活性下降比较缓慢,四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂 和果蔬酶促褐变的防止,1.,激活剂,多酚氧化酶的活性形式是含铜的酶单体的寡聚体，激活剂的作用是,使酶蛋白以一定的聚合度存在,，才有生物活性。,SDS,、,Cu,2+,、酸、尿素等,2.,抑制剂和果蔬酶促褐变的防止,酶促褐变,:,较浅色的水果、蔬菜在受到,机械性损伤,（削皮、切片、压伤、虫咬、磨浆、捣碎）及处于,异常环境变化,（受冻、受热等），在酶促（催化）下氧化而呈褐色，称为酶促褐变,西瓜、香瓜、桔子、柠檬,无酚酶，不褐变。,亚硫酸类是酚酶抑制剂。,褐变防止方法,酶促褐变的,三个条件,，缺一不可。,即：多酚类物质、酚酶、氧气,除去多酚类物质困难，不现实。,一般为 降低酚酶活性、驱氧,(1),加热钝化酶活性,75,95,、,5,7S,的加热处理，可使大部分酶活性丧失。,常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌,加工中，必须严格控制时间和温度。,加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变，但会影响食品品质；加热不足，不能抑制酶褐变。,微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风味。,(2),螯合酶促作用的金属离子,金属（铁、铜、锡、铝等）离子是多酚氧化酶的激活剂。,Fe,3+,、,Fe,2+,、,Cu,2+,能促进褐变主要是因为铁和铜不仅能和酚类化合物反应形成褐色物质，而且能催化还原酮类的氧化。,柠檬酸对,Cu,2+,有螯合作用。,EDTA,是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离子对褐变反应的促进作用，但其与作用对象有关，有的效果则不明显。,(3),酸处理法,多数酚酶最适,pH,6,7,，,pH 3,失活,(,高酸性环境会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致,PPO,逐渐失活，酶活性趋于最低。,),常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混合酸。,柠檬酸可降低,pH,，还可络合酚酶辅基,Cu,2+,，,但单独用效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。,实践证明：,0.5%,柠檬酸,+0.3%,抗坏血酸,效果好。,抗坏血酸不但能降低体系,pH,，而且具有还原剂的作用，可将体系中的醌类及其衍生物还原成酚，并通过自身氧化来减少体系的含氧量。,（,4,）,酶活抑制剂,亚硫酸类是酚酶抑制剂。,常用的有：二氧化硫、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠,(Na,2,S,2,O,4,),如：,在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中，常用二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。,实验表明：,10ppm,可抑制酚酶活性，但有挥发损失，还与醛类加成等。实际应用,300ppm,，残留,20 ppm,。,在微酸性（,pH,6,）时，抑制酚酶的效果最好。,防止原因有三,：,a.,抑制酶活性,b.,将醌还原为酚,c.,与醌加成，防止聚合,(5),驱氧,通过沸水烫漂、抽真空（,93kPa,，,5,15min,）、高浓度抗坏血酸溶液浸泡、气调包装设计等均可达到驱除食品内氧气的目的，从而抑制酶褐变的发生。,控制氧气含量用抽空处理技术或添加去氧剂等方法：用,2%,食盐,+0.2%,柠檬酸,+0.06%,偏重亚硫酸钠溶液作抽空液，在,500mmHg,的真空度抽空,5,10min,可取得良好的护色效果。,褐变的利用,期望的褐变,苹果酒、红茶发酵（生成茶红素）、可可粉、葡萄干、梅干、椰枣、无花果。,红茶是全发酵茶，茶中的多酚物质主要是儿茶素经多酚氧化酶与过氧化物酶的作用，氧化并聚合生成茶色素。,红茶中含有三种酚性色素,茶红素、茶黄素和黄酮醇甙。,五、多,酚,氧化酶的分子形式,多酚氧化酶有多种分子形式,原因：类似的亚基不同程度的聚合；不同亚基不同方式的结合,;,酶蛋白质构象的改变,;,前三种情况的结合。,多酚氧化酶多种分子形式之间的差别表现在底物特异性、最适,pH,、温度稳定性、对抑制剂敏感性、氧化和羟基化活力的差别。,六、多酚氧化酶活力测定,多酚氧化酶活力的测定方法可以分为两类,测定底物消失的速度,测定产物生成的速度,限于测定反应的初速度。,PPO,活性测定,终点法,多酚氧化酶,催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌类反应，以儿茶酚为,多酚氧化酶,的,底物,，其氧化产物在,416nm,处有最大光吸收。,测定系统,：,1.5ml 20mmol/L,邻苯二酚（溶于,0.05mol/L,pH6.8KH,2,PO,4,-NaOH,缓冲液中，然后再加入,0.1ml,酶提取液，保温,37,C,，三氯乙酸终止反应，并,4000r/min,离心,5min,，取上清液，适当稀释。以空白为对照，用分光光度计测定其在,416nm,波长下的,O.D,值。,酶活性单位,为在测定条件下，每分钟引起吸光度改变,0.01,所需的酶量,动态法,PPO,活性的测定,取,0.05mol/L,pH6.8KH,2,PO,4,-NaOH,缓冲液,1.5ml,于,1cm,比色皿中，加入,1ml 20mmol/L,邻苯二酚溶液，,PPO,酶液,0.5ml,，混匀后在,416nm,处比色，酶液加入后开始记时，每,30s,记录一次,OD,随时间的变化值，以最初直线段的斜率,(,OD/t),计算酶活力。,一个,酶活力单位,定义,为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变,0.01,所需的酶量。,七、水果和蔬菜中的 多酚氧化酶及其底物,正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与,PPO,酶存在于不同部位。这种分布是通过一系列膜系统实现的，受,膜屏障的作用,，这种区域性的分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正常组织是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的区域化分布破坏，,PPO,与酚类物质接近并与其发生化学作用，这将导致褐变。,水果,有更大的有着,较弱薄片成分的细胞,，冷藏时易发生,细胞壁破裂,，使,PPO,与酚类物质接触，产生褐变。,1.,苹果中多酚氧化酶,引起苹果褐变的重要原因之一,未成熟的苹果比成熟的更易褐变,在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期间是增加的,2.,梨中的多酚氧化酶,梨多酚氧化酶,仅作用于,邻苯酚,与,对苯酚,、,间苯酚,和,一元酚,无作用,以儿茶酚为,底物,该酶的最适,pH,为,6.5,在,30,活性最强,.,亚硫酸氢钠、维生素,C,、柠檬酸对梨中多酚氧化酶的抑制作用依次减弱,硫酸钠几乎无抑制作用,不同底物和同底物不同浓度影响多酚氧化酶特性,.,3.,桃,促使衰老的因素，可促进褐变，抑制衰老的因素可抑制桃果实的褐变,桃低温下的褐变与逆境条件下不正常衰老有关,酚类物质含量和,PPO,活性在果实近成熟时下降,，所以适当延迟采收期可显著减少桃组织褐变的发生,4.,马铃薯,马铃薯匍匐茎、块茎、花及根中的,PPO,活性明显强于叶和茎，而块茎外皮和花中子房及花药,PPO,活性也高于同器官的其他部位,马铃薯,中,PPO,的最适温度为,30,在,80,处理,5min,90,处理,2min,PPO,活性基本丧失,.,考虑到马铃薯淀粉加热可能变性的特点,在加工中,不宜采用热处理的方法防止褐变,.,马铃薯中,PPO,的最适,pH,为,6.6,在,pH6-7,之间酶的活力较高,在加工中应尽量避开此,pH,范围,可,采用,pH4.5,左右来加工,.,二巯基丙醇,亚硫酸钠,半胱氨酸,抗坏血酸,对,PPO,活性具有强烈的抑制作用,能有效地防止,PPO