实验酶联免疫吸附测定共28张课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基础医学院免疫学教研室,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验酶联免疫吸附测定,46、法律有权打破平静。马格林,47、在一千磅法律里，没有一盎司仁爱。英国,48、法律一多，公正就少。托富勒,49、犯罪总是以惩罚相补偿；只有处罚才能使犯罪得到偿还。达雷尔,50、弱者比强者更能得到法律的保护。威厄尔,实验酶联免疫吸附测定实验酶联免疫吸附测定46、法律有权打破平静。马格林,47、在一千磅法律里，没有一盎司仁爱。英国,48、法律一多，公正就少。托富勒,49、犯罪总是以惩罚相补偿；只有处罚才能使犯罪得到偿还。达雷尔,50、弱者比强者更能得到法律的保护。威厄尔酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）免疫学教研室 抗原-抗体反应的基本检测方法凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。补体参与的反应免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。基础医学院免疫学教研室,课程内容,ELISA,的原理,ELISA,的分类,间接,ELISA,的具体操作,ELISA,在医学中的应用实例,基础医学院免疫学教研室,酶免疫测定,(enzyme immunoassay,EIA),酶联免疫吸附试验,(enzyme linked immunosorbent assay,，,ELISA,),原理：将抗原（抗体）,固相化,，与酶标记的相应抗体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,方法：,直接,ELISA,、,间接,ELISA,、夹心,ELISA,、竞争,ELISA,等,基础医学院免疫学教研室,ELISA,的原理,1.,抗原抗体反应的特异性,2.,抗原或抗体的固相化,3.,抗原或抗体的酶标记,E,基础医学院免疫学教研室,ELISA,的分类,（一）直接法,（二）间接法,（三）双抗体夹心法,（四）竞争法,基础医学院免疫学教研室,直接,ELISA,酶标一抗,基础医学院免疫学教研室,间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。,其优点在于只要变换包被抗原就可利用,同一酶标抗抗体,建立检测相应抗体的方法。可用于传染病的诊断。,间接法（测抗体）,基础医学院免疫学教研室,夹心,（检测抗原）,只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于,包被固相载体,和制备,酶结合物,而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如,HBsAg、HBeAg、AFP,等。,基础医学院免疫学教研室,竞争抑制法（检测抗原）,待检抗原与标记抗原竞争结合抗体。,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等,ELISA,测定多用此法。,基础医学院免疫学教研室,wash,TMB,标准,HBcAg,标准酶标,HBc,Ab,wash,待检,HBcAb,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如,HBeAb,，,HBcAb,；,基础医学院免疫学教研室,间接,ELISA,实验目的：,测小鼠,IgG,免疫兔血清中抗小鼠,IgG,抗体的效价,实验材料：,包被抗原：小鼠血清,待检抗体,/,一抗,：兔抗小鼠,IgG,酶标抗体,/,二抗,：,HRP-,驴抗兔,IgG,聚苯乙烯酶标板 水浴箱,移液器 枪头,包被液：,pH9.6,的碳酸盐缓冲液,封闭液,/,封,：,5%,脱脂奶粉,(ALB),稀释液,/,稀,：,pH7.4 0.05M,的,PBS,（磷酸盐缓冲液）,洗液：,PBST,（,PBS+0.1%,吐温,20,）,显色液：,OPD,（邻苯二胺）,终止液,/,终,：,2M,硫酸,鼠,IgG(,抗原,),兔抗小鼠,IgG(,一抗,),HRP-,驴抗兔,IgG(,二抗,),免疫,Fc,段,基础医学院免疫学教研室,操作步骤,包被：,正常小鼠血清（,IgG,）包被，,100,l/,孔，,4,过夜,封闭：,弃去包被液，加入,5%,脱脂奶粉封闭（,2,00,l/,孔,），,37,20min,弃去封闭液，用洗涤缓冲液（,PBS/Tween20,）,洗板,3,次,加入一抗：,加入不同稀释度的兔抗鼠,IgG,血清（,100,l/,孔,），以,200,起始，空白对照孔用洗液代替，,37,20min,洗板,3,次,加入酶标二抗：,加入,HRP-,驴抗兔抗体（,100,l/,孔,），,37,20min,洗板,3,次,显色：,加入底物,100,l/,孔。室温避光显色,5-10min;,2MH,2,SO4,终止反应,结果判定,间接,ELISA,基础医学院免疫学教研室,E,E,终止液终止显色,A,B,两排同样操作，每孔加,ul!,包被：,1,：,5000,稀释的正常小鼠血清，,4,过夜,加酶标抗体：,1:5000,稀释的,HRP,标记的驴抗兔,IgG,抗血清，,37 15min,加待检抗体：,倍比稀释的兔抗鼠,IgG,抗血清，,37 15min,洗涤：,3,次，,1min/,次,封闭：,5%,脱脂奶粉，,37 20min,终止液,50ul,空白对照无显色,加底物液显色,底物液,100ul,洗涤：,3,次，,1min/,次,洗涤：,3,次，,1min/,次,基础医学院免疫学教研室,A,B,排上样完全相同：复孔,A,B,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,2-12,号每孔,00uL,稀释液，,号孔加入,200uL,一抗，从号孔吸取,100uL,加到号孔中，混匀，从号孔吸取,100uL,加到号孔中，混匀，号孔吸取,uL,，丢弃！,每孔终体积,100uL,无,Ab,仅稀释液,基础医学院免疫学教研室,病原微生物及其抗体检测如,:,肝炎病毒,SARS,等,临床疾病诊断中的应用,蛋白质测定,:,各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物,非肽类激素测定：,T3,、,T4,，性激素测定,ELISA,在医学中的应用,基础医学院免疫学教研室,ELISA,在其他相关领域中的应用,科研服务,食品安全,环境卫生,基础医学院免疫学教研室,DH,2,+H,2,O,2,D,+2H,2,O,DH,2,为供氢体，,H,2,O,2,为受氢体。,DH,2,一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。,酶催化底物液显色,E,基础医学院免疫学教研室,酶/,E,底 物/,DH,2,显色反应,测定波长,nm,辣根过氧化物酶,(HRP),邻苯二胺,(OPD),四甲替联苯胺,(TMB),氨基水杨酸邻联苯甲胺,2,2-,连胺基,-2(3-,乙基,-,并噻唑啉磺酸,-6),铵盐,橘红色,黄色,棕色兰色蓝绿色,492,450,449425642,碱性磷酸酯酶,(AP),4-,硝基酚磷酸盐,(PNP),萘酚,-AS-Mx,磷酸盐,+,重氮盐,黄色红色,400500,葡萄糖氧化酶,(GOD),ABTS+HRP+,葡萄糖葡萄糖,+,甲硫酚嗪,+,噻唑兰,黄色深蓝色,405,420,-,半乳糖苷酶,(-Gal),甲基伞酮基半乳糖苷,(4MuG),硝基酚半乳糖苷,(ONPG),荧光黄色,360,450420,基础医学院免疫学教研室,结果的判定,肉眼判定结果：,于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“”、“”表示。各组各人独立观察记录。,测定,A,值：,在酶标仪上，根据不同底物设定波长（,OPD,底物为,490nm,，,TMB,底物为,450nm,），以空白孔调零后测各孔,OD,值。以高于阴性对照孔,OD,值,2,倍为阳性。,基础医学院免疫学教研室,结果的判定,空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅,待检样品孔显色明显,空白对照,基础医学院免疫学教研室,定量方法：标准曲线,待检样本,基础医学院免疫学教研室,注意事项,对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）,倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行,终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准,2M H,2,SO4,具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢,基础医学院免疫学教研室,需要搞清楚的问题,1.,什么是免疫标记技术？为什么要进行标记,?,三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。,2.ELISA,的原理、定义及基本分类,3.,实验对照的设立及其意义,4.,了解,ELISA,在临床中的广泛应用,基础医学院免疫学教研室,66,、节制使快乐增加并使享受加强。,德谟克利特,67,、今天应做的事没有做，明天再早也是耽误了。,裴斯泰洛齐,68,、决定一个人的一生，以及整个命运的，只是一瞬之间。,歌德,69,、懒人无法享受休息之乐。,拉布克,70,、浪费时间是一桩大罪过。,卢梭,