CD34+ 细胞及分离方法PPT演示课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,CD34+,细胞分离及其体外扩增,1,CD34+,细胞,CD34+,细胞是造血干细胞的表面标志分子。,细胞表面,CD34+,抗原是一种相对分子质量为,110-120kD,的高度糖基化的,型膜蛋白。它主要存在于幼稚的造血干细胞和造血祖细胞质膜上，部分骨髓基质细胞以及少量内皮细胞表面。,2,CD34+,细胞在骨髓，脐带血以及外周血中都有存在。用常规方法一般难以有效分离。原因主要在于,CD34+,抗原表达的拷贝较低，抗,CD34+,的亲和力低，表达,CD34+,抗原的细胞存在于一个不均一的本底细胞群中，且数量极少。,3,分离,CD34+,细胞的方法,荧光激活细胞分选,免疫吸附系统 （淘选法；免疫吸附柱层析法；免疫磁珠法）,细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计数流式法）,4,流式细胞分选,(fluorescence activated cell sorting,FACS),可获得高纯度的,CD34+,细胞，但是由于得量较少，受无菌实验条件等方面的限制，所以应用较少。,细胞物理参数系统分离,CD34+,细胞得率较低，而且需要提供足够的细胞量。,5,目前常用于分离,CD34+,细胞的方法主要是免疫吸附法（,systems based on immunoadsorption),。,尤其是用免疫磁珠吸附分离（,immune adsorption on ferromagnetic beads),的方法应用更为广泛。,6,CD34+,细胞分离方法比较,7,免疫磁珠吸附分离,CD34+,细胞,利用抗,CD34,单克隆抗体与抗原特异结合的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合，使用,Miltenyi,的磁性细胞分离仪，有效的分离纯化,CD34+,细胞，进一步用于造血细胞培养，扩增，基因转染，建立造血干细胞库等实验。,8,实验材料：,1.,脐带血，外周血及骨髓标本；,2.PBS,缓冲溶液；,3.10%BSA,；,4.10mmol/LEDTA,；,5.,淋巴细胞分离液；,6.MACS,磁性分离仪；,7.MACS,分离试剂盒；,9,操作步骤,1.,配制含,1%BSA,和,5mmol/L EDTA,的,PBS,缓冲溶液。,2.,利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；,3.,将,1*108,个单个核细胞悬浮于,300ul,缓冲液中，利用,MACS,磁性分离试剂盒制备细胞悬液,500ul,；,4.,将分离柱固定于,MACS,磁场内，将标记细胞缓慢通过分离柱。洗脱组分为,CD34-,细胞；,5.,将分离柱移出磁场，加,1ml,缓冲液加压洗脱，收集,CD34+,细胞。,6.,用免疫细胞化学和,FACS,分析,CD34+,细胞纯度,10,分离结果,分离前，脐带血和骨髓的,CD34+,细胞占单个核细胞的,1-4%,，外周血仅为,0.2%,。,分离后，,CD34+,细胞可达,95-99%,。,CD34+,抗原组则,99.6%,的细胞为,CD34-,细胞。,回收率达,70-75%,，免疫磁珠分离方法得到的,CD34+,细胞纯度和回收率均较高。,11,体外培养脐血单个核细胞与,CD34+,富集细胞的比较,目的：在相同的条件下体外培养脐血单个核细胞（,MNC,）和,CD34+,富集细胞，对比考察这两种细胞扩增，集落形成和,CD34+,细胞扩增等特性。,12,方法,1.Ficoll,密度梯度离心收集单个核细胞,;,2.,免疫磁珠分离纯化,CD34+,细胞,.,3.MNC,接种密度为,5*105 cells/ml.CD34+,细胞为,2*104 cells/ml,于,24,孔板，每周取样计数，集落检测和流式细胞分析,.,13,结果,脐血,CD34+,细胞的分离结果,14,MNC,扩增到第,28,天，细胞总数开始呈下降趋势，而另一组则持续扩增,8,周。在前,4,周中，,MNC,的扩增倍数远低于,CD34+,富集细胞,15,造血干,/,祖细胞集落密度分析,细胞于半固体培养体系中进行集落分析，,MNC,的,CFU-GM,和,BFU-E,集落密度都有上升，下降的过程，而,CD34+,富集细胞集落密度始终呈下降趋势，相似的是两者,BFU-E,到第,3,周就很难检测到了。,集落密度,=,集落,/,细胞数,16,造血干,/,祖细胞总集落扩增分析,总集落数,=,集落密度,*,细胞总数,MNC,的,CFU-GM,和,BFU-E,的扩增倍数在,14,天达到最大值，然后开始下降。,CD34+,富集细胞的,CFU-GM,第,35,天达到最大值，,CFU-E,在第,14,天达到最大值。后者的,CFU-GM,最大扩增倍数远大于前者。,17,分析可以看出，,MNC,的集落在培养过程中其集落密度和集落数量都曾实现了增高。,而,CD34+,富集细胞的集落只实现了数量上的扩增，单个细胞所形成的集落数并没有明显的增高过程。,18,显示，,MNC,的,CD34+,细胞的扩增倍数在第,14,天达到了最大值，随后开始下降，,CD34+,富集细胞则如终呈上升趋势，在第,35,天达到了最大值。,经过体外长期培养，由,CD34+,富集细胞培养所得的,CD34+,细胞总数和,CFU-GM,（粒细胞,-,单核细胞集落生成单位）总数均高于,MNC,。,19,小结,经过体外培养，培养前期,MNC,的,CD34-,可能对,CD34+,细胞及集落形成细胞的扩增有促进作用；,而,CD34+,富集细胞在培养过程中分化趋势始终大于扩增，其总细胞的大量扩增则说明在培养中存在大量分化。,20,讨论与总结,MACS,技术在实验室处理低细胞量情况下，是目前纯化,CD34+,细胞较好的方法。,CD34+,细胞具有良好的扩增潜力，通过体外培养，,5,周内即可以得到更多的,CFU-GM,形成细胞和,CD34+,细胞。,CD34+,细胞的大量扩增为造血干,/,祖细胞的定向诱导分化提供了有利条件。,21,谢谢,22,