L5-三章测序与合成ppt课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 核酸分析与合成第一节 核酸序列分析,1975年，Sanger加减法,Maxam-Gilbert化学法,1978年，Sanger,末端终止法，1958 胰岛素顺序+1980 测序,一、加减法,1、原理,*0-系统:不等长度片段,*加法：T,4,DNA Polymerase+1dNTP(3,5外切 5,3聚合）,*减法：DNA PolymeraseI+3dNTP,2、应用举例,0-系统的产生,加法系统与减法系统,第三章 核酸分析与合成第一节 核酸序列分析,1,0,系统的产生,0系统的产生,2,0系统 +A +G +C +T ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG-TACGAC -TACGA,C,-TACG,AC,-TACGAC -T,ACGAC,-TACGA -TACGA -TACG,A,-TAC,GA,-T,ACGA,-TACG -TA,CG,-TACG -TAC,G,-T,ACG,-TAC -TA,C,-,TAC,-TAC -T,AC,-TA -TA -,TA,-,TA,-T,A,-T -,T,-,T,-,T,-T 2种片段 1种片段 2种片段 1种片段,下划线为切去的碱基,加法系统,0系统 +A,3,0系统 -A -G -C -T,ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG,-TACGAC -TACGAC -TACGAC-TACGAC -TACGAC,-TACGA -TACGA,C,-TACGA,C,-TACGA -TACGA,C,-TACG -TACG -TACG,AC,-TACG,A,-TACG,AC,-TAC -TAC,G,-TAC -TAC,GA,-TAC,GAC,-TA -TA,CG,-TA,C,-TA -TA,CGAC,-T -T -T,AC,-T,A,-T,ACGAC,3种片段 2种片段 3种片段 1种片段,下划线为加上的碱基,减法系统,0系统 -A,4,5标记后电泳、放射自显影：读序与模板的关系、加减系统存在的必要、0系统存在的必要,ATGCTG,-A G C -T,+A +G +C +T,0,减法,加法,5-TACGAC C 3,-TACGA A,-TACG G,-TAC C,-TA A,-T T 5,5标记后电泳、放射自显影：读序与模板的关系、加减系统存在,5,二、特异化学试剂裂解法,1、原理:化学修饰碱基-糖苷键和磷酸酯键不稳定而水解,2、特异化学试剂裂解,嘌呤-硫酸二甲酯 嘧啶-肼和呱啶,*裂解G和A的反应（GA）,*强化A的裂解（AG）,*裂解C和T的反应,*裂解C的反应,举例,二、特异化学试剂裂解法1、原理:化学修饰碱基-糖苷键和磷酸酯,6,5*pGTAC,GA AG C+T C,5*pG 5*pG 5*pGT,ll,5*pGTA 5*pGTA 5*pGTAC 5*pGTAC,GA AG C+T C,C,A,T,G,5,C 3,7,三、末端终止法,DNA聚合酶I及 2,3-双脱氧核苷酸（ddNTP）,1、原理（,genetic-rec-seq,）,2、单链的产生：M13,3、停止与压缩反应,停止-M13的二级结构，阻止延伸-提高温度,压缩-由于产物的二级结构，多条条带走到一起-改变变性胶条件,4、测序自动化,三、末端终止法DNA聚合酶I及 2,3-双脱氧核苷酸（,8,3,GTAGCAACT,5 d(ACG)TP+dTTP+ddTTP,d(ACT)TP+dGTP+ddGTP,d(AGT)TP+dCTP+ddCTP,d(,GCT)TP+dATP+ddATP,T,组,G,组,C,组,A,组,3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT5 CAddT*5 CATCddG*5 CATddC*5 CddA*CATCGddT*CATCGTTddG*ddC*CATCGTTGddA*CATCGTddT,*,A,G,T,T,G,C,T,A,C,电泳方向,9,DNA测序中作链终止剂的核苷类似物,2,3-双脱氧核糖核苷5-三磷酸,DNA测序中作链终止剂的核苷类似物 2,3-双脱氧核,10,L5-三章测序与合成ppt课件,11,复习提纲,1、加减法DNA测序的原理及其实例。,2、特异化学试剂裂解法进行DNA测序的原理和实例。,3、末端终止法进行DNA测序的原理和实例,。,4、什么是停止与压缩反应？,复习提纲1、加减法DNA测序的原理及其实例。,12,第二节 基因的化学合成及诱变,1955 Todd 二核苷一磷酸,磷酸二酯-磷酸三酯-亚磷酸三酯,液相-固相-自动化,1981 有活性tRNA,Ala-,上海生化所-世界上第一个具有全部生物活性的人工核酸分子,一、化学合成法,1、保护基及其去除,第二节 基因的化学合成及诱变1955 Todd 二核苷一磷酸,13,核糖-OH、P、碱基的NH,2,对保护基的要求：无付反应、稳定、易脱、脱保时链完整,2、缩合剂,磷酸酯键的形成（脱水反应、有机溶剂进行）,双环己基碳二亚胺 DCC,三甲基苯磺酰氯 MS,3、合成方法,（1）磷酸二酯法,付产物多、产率低、操作复杂,核糖-OH、P、碱基的NH2,14,保护的基团,保护基的分子式,缩写符号,保护基的去除方法,末端磷酸基,-CH,2,-CH,2,-CN,-,氰乙基,-CE,碱解、氨解,核苷间磷酸基,Cl-,对氯苯基,PCP,碱解、氨解,2-OH,-COCH,3,乙酰基,Ac,同上,G-NH,2,-COCH(CH,3,),2,iB,浓氨水,保护的基团保护基的分子式缩写符号保护基的去除方法末端磷酸基-,15,(2)磷酸三酯法:核苷间的磷酸基以三酯存在,付产物少、磷酸基被保护可用硅胶柱分离、产率高、反应时间短速度快,(3)亚磷酸三酯法,反应速度快、可固相合成,原理：*末端核苷（3的第一个碱基）固定在高分子化合物上（聚苯乙烯纤维、硅胶、微孔玻璃珠）,*循环反应,*洗涤除去未反应物和付产物、简化分纯、加快速度,L5-三章测序与合成ppt课件,16,L5-三章测序与合成ppt课件,17,4、合成寡核苷酸纯化方法,*脱盐：（乙醇沉淀、分子筛、反相柱C18）纯度低,*OPC,柱纯化：（DMT）有短链、不适合基因合成和DNA序列分析、不宜纯化多于40mer的oligo,*HPLC纯化：吸附于反相柱的差异、用于PCR反应；基因合成和DNA序列分析（较纯，40mer、Grich不适用、设备要求高）,*PAGE纯化：可用于任何反应（最纯、无限制、但费事、有毒）,二、寡核苷酸化学合成的实际用途,（1）基因合成的元件,（2）核苷酸序列分析的引物,（3）核酸分子杂交的探针,（4）突变研究,4、合成寡核苷酸纯化方法,18,L5-三章测序与合成ppt课件,19,三、基因突变,1、寡核苷酸诱发基因定点突变,（1）原理,突变的寡核苷酸为引物合成DNA-复制-突变,（2）寡核苷酸诱发定点突变过程,M13,正链DNA与突变引物结合-延伸制备异源双链DNA分子-异源双链DNA分子的富集（S1核酸酶、碱性蔗糖密度梯度离心）-转化-筛选（序列分析、限制酶切、杂交、生物学）,突变位点保护：错配碱基外有一个以上碱基,三、基因突变,20,L5-三章测序与合成ppt课件,21,2、缺失突变,（1）特定位点,*酶切（只产生一个酶切位点）,*缺失突变探针,（2）随机位点,*DNaseI-在双链产生单链缺口-缺口扩大-S1平端化-重新环化=一组缺失突变体,3、插入突变,（1）位点特异性插入（利用限制酶位点）,（2）随机插入（利用化学合成的接头）,2、缺失突变,22,L5-三章测序与合成ppt课件,23,/-AAGCTT-GAATTC-/EcoRI /-AAGCTT-G AATTC-/Pol,/-TTCGAA-CTTAAG-/-TTCGAA-CTTAA G-/,/-AAGCTT-GAA,TTAA,TTC-/,/-TTCGAA-CTT,AATT,AAG-/,/-AAGCTT-GAATTC-/EcoRI,24,L5-三章测序与合成ppt课件,25,4、盒式突变(cassette mutagenesis),原理：通过一次寡核苷酸的合成，在一段DNA区域内（20-80nt）产生众多的突变,在预定位点，除正常核苷酸外，以10%添加另三种核苷酸一组兼并寡核苷酸,ATAGTCCCA,4、盒式突变(cassette mutagenesis)AT,26,复习提纲,5、化学法合成核酸时，哪些基团需要保护？对保护基的要求是什么？,6、核酸的化学合成都有哪些方法？现在常用的是哪种？其原理和过程是什么？,7、合成寡核苷酸纯化方法有哪些？各有怎样的应用范围和局限？,8、寡核苷酸化学合成的实际用途？,9、寡核苷酸诱发基因定点突变的原理和过程。,10、如何诱发缺失突变？如何诱发插入突变？,11、什么是盒式突变？其原理是什么？,复习提纲5、化学法合成核酸时，哪些基团需要保护？对保护基的要,27,