1、糖组学(glycomics)的背景及研究意义课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 7 糖组学,1,、糖组学,(,glycomics,),的背景及研究意义,20,世纪末,继基因组学、蛋白质组学之后,糖组学也日益受到人们关注。顾名思义,糖组学是对糖链组成及其功能研究的一门新学科,是基因组学的后续和延伸,具体内容,包括研究糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用,其主要研究对象为聚糖。丰富多样的聚糖覆盖了生物有机体的所有细胞,不仅体现细胞的类型和状态,也参与了许多生物学行为,如细胞发育、分化、肿瘤转移、微生物感染、免疫反应等,;,聚糖还体现生物和分子的进化作用,如糖酵解、生物合成的保守性以及核糖的起源等。,示例：糖链的生物学功能,（,1,）,糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用,研究表明：糖蛋白,N-,糖链在参与新生肽的折叠，维持蛋白质正确构象时起重要作用。,红细胞血凝素，如,N-,糖链,缺乏,则不能折叠呈三聚体,（,2,）,糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性,免疫球蛋白如缺乏,N-,糖链则不,能分泌到胞外而留在内质网中,（,3,）,糖链参与分子识别和细胞识别,血清中很多蛋白质式含有以唾液酸残基为末端的,N-,糖链糖蛋白，称唾液酸糖蛋白，如免疫球蛋白、蛋白质激素，载体蛋白等。,如被唾液,酸酶降解,与肝,细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体结合,胞吞作用并降解,与血浆中老蛋白的清除有关,与精卵识别有关,受精是精子与卵子的融合。哺乳动物的卵子外面有一层透明的糖蛋白外衣，称透明带（,zone,pelluci,da,ZP,),。,透明带由,ZP-1,、,ZP-2,和,ZP-3,三种糖蛋白组成,受精中起主要作用的是,ZP-3,连接在,ZP-3,上的,O-,GalNAc,糖链能被精子表面上的凝集素受体识别,(,有物种特异性,),。,O-,GalNAc,糖链的非还原端是一个,一连接的半乳糖残基,它可能在精卵识别中起关键作用。,与,细胞粘着有关,细胞粘着,(cell adhesion),是进化中随着多细胞生物出现的必然现象。多细胞生物中细胞有相互识别而聚集成细胞群的能力,细胞粘着。细胞群或组织,(tissue),中细胞与细胞之间充满着由糖蛋白,(,胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白,),、蛋白聚糖、透明质酸等组成的胞外基质,(,extracellular,matrix,ECM),。,在整个生物体中,ECM,形成一个连续的主体网络结构,所有的细胞都交织或浸泡在这一网状基质中,网络中细胞一细胞粘着,细胞一,ECM,粘着都是通过有关的膜内在蛋白质,(integral membrane protein),完成的。这些膜蛋白称细胞粘着分子,(cell adhesion molecule,CAM),或粘着蛋白,包括,整联蛋白,(,integrin,),钙粘着蛋白,(,cadher,-in),免疫球蛋白超家族,(,Ig,superfamily,),血管地址素,(,vescular,addressin,),选择蛋白,(,selectin,),等。,CAM,绝大多数都是含,N,一糖链的糖蛋白,.,例如整联蛋白是由,一和,一亚基组成的异二聚体,两个亚基上有多个,N,一糖基化位点。去糖链的整联蛋白完全失去与纤连蛋白的粘着能力,。,（,4,）,糖链影响糖蛋白的生物学活性,糖链与酶活性,糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护等方面普遍起作用。但糖链与成熟酶活性的关系因酶而异。有些酶除去糖链活性不受影响,如,UDP-,葡糖醛酸酶,、酵母羧肽酶等。有些酶的活力依赖其糖链的存在，,如,溶酶体,一葡糖苷酶,除去糖链后只有免疫活性而而完全没有酶活力。,糖链与激素活性,糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括,FSH(,促卵泡激素,),LH(,促黄体生成激素,),和,TSH(,促甲状腺 激素,),以及胎盘绒毛膜促性腺激素和肾脏红细胞生成素,(,erytlmpoietin,EPO,),等。,FSH,、,LH,和,TSH,均由,亚基和,亚基组成,两个亚基都有,N,一糖链。糖链呈高度不均一性,例如,LH,和,TSH,中精链的外链末端有些为,SO,4,-,-4GalNAc,1,，有些为,Sia,2 3Gal,1,而,FSH,中的糖链都是以,Sia,2 3Gal,1,为末端的。已经证明，带有,SO,4,-,-4GalNAc,1,末端结构的激素对受体的亲和力比带有,Sia,2 3Gal,1,末端的激素高，但在体内的半寿期前者比后者短,因为在肝脏网状细胞表面有特异结合,SO,4,-,-4GalNAc,1,为末端的糖链的受体,而,Sia,为末端的糖链则必须经唾液酸酶水解除去,Sia,从而暴露,Gal,后才能被半乳糖结合受体识别并清除。,糖链与,IgG,活性,每分子,IgG,均含糖链约三条，几乎全部,N,一糖链都是复杂型,非还原末端残基为,Sia,或,Gal(,去,Sia,),少数为,GlcNAc,(,去,Sia,-Gal),IgG,的,N-,糖链多达,30,余种,呈高,度不均一性。如,IgG,的,N,一糖链缺失外链,Gal(,这种糖链称,G,0,糖链,）后,可成为一种自身抗原,被免疫系统识别而产生自身抗体。后者能与带有,Go,糖链的,Ig,G,生成,免疫复合体,，沉积于关节腔内,引起炎症。这种免疫复合体是,由带,Go,糖链的,IgGFc,段,(,作为抗原,),和带末端,Sia,的,IgG,(,作为抗体,),Fab,段结合而成,实际上是,IgG,的自身聚合物。类风湿性关节炎、红斑狼疮,等都是一种与,IgG,的糖链结构改变有关的自身免疫病,(autoimmune disease),。,类,风湿关节炎,总 之,毫无疑问,如果试图深入了解生命的复杂规律,就必须有“,基因组蛋白质组糖组,”的整体观念,这样才有可能揭示自身全部基因功能,从而进一步深入研究疾病的发病机制,有效控制疾病的发生、发展及预后,以及筛选疾病、预测诊断标记物和开发新的药物靶标。,2,、,糖组学的研究策略,糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。,目前糖组学关注的焦点是糖蛋白,为了更好地与蛋白质组学相关联,将研究对象锁定为糖肽。研究核心策略为,:,(1),分析单物种生物所产生的所有聚糖,;,(2),以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因,;,(3),结合有效的理化和生化性质,研究糖蛋白糖链的性质。,研究的重点在于,:,(1),编码糖蛋白的基因,;,(2),实际糖基化的位点,;,(3),聚糖结构,;,(4),糖基化的作用。,主要分为三大部分,:,结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学,;,其中结构糖组学主要包括“糖捕获”技术、前沿亲和层析技术等,功能糖组学主要包括微阵列技术等。,3,、糖组学研究技术进展,1,）结构糖组学,根据与糖链连接方式不同,蛋白质主要有,N,连接和,O,连接,两种糖基化形式,:,前者是糖链与蛋白,Asn,XXX,Ser/,Thr,序列子,(XXX,为除脯氨酸以外的氨基酸,),中,Asn,残基上的,NH2,相连,;,后者则是糖链与蛋白,Ser/,Thr,残基上的,OH,相连。,N,连接和,O,连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面,也可以分泌型蛋白的形式存在。此外,糖蛋白还有,GPI,锚定蛋白和近年来在细胞核和细胞质发现的,O,GlcNAc,（,N-,乙酰氨基葡萄糖）修饰蛋白两种存在形式。,A,、,N,糖链,N-,糖链的共同结构花式：核心五糖,Glc,-,葡萄糖；,Gal-,半乳糖；,Man-,甘露糖；,Fru,-,果糖,Rib-,核糖；,Fuc,-,岩藻糖；,Sia,-,唾液酸；,GlcA,-,葡糖酸,GlcUA,-,糖醛酸；,GlcNAc,N-,乙酰葡萄糖胺；,GalNAc,N-,乙酰半乳糖胺；,NeuNAc,N-,乙酰神经氨酸,N-,糖链的分类,复杂型,N-,糖链的分支,B,、,O,糖链,特点：与,N-,糖链相比结构简单，但连接形式多。,几种糖蛋白的寡糖链,小 结,糖链结构信息包括糖链的,单糖组成、异头碳构型、糖苷键的连接位置和糖残基的序列分析,等内容。糖蛋白糖链的结构分析包括糖蛋白的提取分离、糖链释放和糖链结构鉴定等多个步骤。,（,1,）糖蛋白的提取和分离纯化,糖蛋白多定位于细胞表面,属于膜蛋白,水溶性不好,其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。目前常采用先制备质膜,然后用,CHAPS,等去污剂释放或,Triton X,114,相分离、有机溶剂萃取等方法提取糖蛋白。获得的糖蛋白主要采用,透析、超滤、电泳和层析等,方法来分离纯化,其中由,几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素亲合层析,(serial,lectin,affinity chromatography,SLAC),法是较好的方法。,SLAC,研究发现，植物凝集素是一类能选择性地结合糖链的糖结合蛋白。利用这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白,/,糖链。用于纯化糖蛋白,/,糖链的植物凝集素主要有,刀豆凝集素,(,concanavalin,A,Con A),、麦胚凝集素,(wheat germ agglutinin,WGA),、豌豆外源凝集素,(pea,lectin,),、植物血凝素,(phytohaemagglutinin-E4,E4-PHA),和网孢盘菌凝集素,(,Aleuria,aurantia,lectin,AAL,),等。单一一种凝集素并不能够富集细胞中所有的糖蛋白,/,糖链，因此科学家们在上世纪,80,年代发明了一种被称作连续凝集素亲和色谱,(serial,lectin,affinitychromatography,SLAC),的方法来分离同一细胞中的各种糖蛋白,/,糖链。这种方法是将不同的凝集素亲和柱串联排列，样品混合物依次经过这些亲和柱，这样就可将不同的糖蛋白,/,糖链富集在不同的柱中，提高了糖蛋白,/,糖链的回收效率和混合糖蛋白,/,糖链的分离效果。,The,lectins,tested recognize the following residues:,-D-galactosyl,Ricinus,communis,agglutinin 120,(RCA-1)and peanut agglutinin,(PNA);,-D-,galactosyl,Griffonia,simplicifolia,agglutinin(GSA);,-D-,mannosyl,-D-,glucosyl,concanavalin,A(,ConA,)and,Lens,culinaris,agglutinin(,LcH,);,N,-acetyl-and,N,-,glycolylneuraminic,acid,Limax,flavus,agglutinin(LFA),and,Limulus,polyphemus,agglutinin(LPA);,N,-acetyl-,glucosaminyl,and,sialyl,wheat germ agglutinin(WGA);,N,-acetyl-D-,galactosaminyl,Helix,pomatia,agglutinin(HPA)and,Dolichos,biflorus,agglutinin(DBA)and,-L-,fucosyl,Ulex,europeus,agglutinin(UEA-1).,（,2,）,糖链的释放,纯化后的糖蛋白样品即可进行糖链释放。糖链释放一般有化学释放和酶释放两种方法。,化学法主要有,肼解法和,消除法,前者可释放糖蛋白的,N,糖链和,O,糖链,目前已实现仪器自动化。但因该法反应条件剧烈,肼解后需对糖链进行乙酰化复原处理,而且蛋白部分已经破坏,无法进行有关糖基化位点的研究。,酶法释放糖蛋白糖链因方法简单,条件温和,能够提供有关糖链残基组成、排列顺序和糖苷键的,或,构型等信息,目前应用较广。较常用的释放,N,糖链的特异蛋白酶有,N,糖肽酶,F(PNGase,F),和,N,糖肽酶,A(PNGase,A),二者具有很好的互补性,常联合使用。而,PNGase,F,因广谱性好,也常单独使用。对于