第7章第3节动物克隆

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三节 动物克隆,克隆,(clone),是指通过无性繁殖的手段，从一个动物细胞获得遗传背景相同的细胞群或个体群的过程。获得的这些细胞叫克隆细胞，个体群称为克隆动物,(cloned animal),。广义上的动物克隆就是指动物的无性繁殖,(asexual reproduction),，即用无性繁殖的手段,由单一个体产生外形、性能和基因型完全一致的多个动物。,1,.,1,克隆技术产生的历史背景,1885年，,Freiberg,大学的动物学教授,August,Weismann,提出了一种新的遗传学理论，他设想受精卵分裂后的每个子细胞只继承了母细胞一半的信息，以此来解释为什么来源于一个受精卵的机体细胞会变成各种各样的特化状态。,胚胎学家,William Roux,宣布他用试验验证了,Weismann,的遗传学理论。他用一个热针破坏掉2-细胞期青蛙胚胎中的一个卵裂球，最后发育成一半的青蛙。,Hans,Adolf,Edward,Dreisch,企图在海胆上重复上述实验时，却得到完全相反的结果。他把2-细胞胚的两个卵裂球分开，结果分别发育成完整的海胆个体。,1 动物克隆发展简史,1902年，德国胚胎学家,Hans,Spermann,用头发将蜥蜴2-细胞胚的两个卵裂球分开，得到与,Dreisch,相同的结果。,结论：这一时期的每个胚细胞拥有完整的遗传信息，可以产生完整的个体。,1902-1903年间，,Walter Sutton,在蝗虫等动物上的研究发现，遗传信息的载体是染色体，染色体位于细胞核中，它在生殖细胞分裂中的行为是随机的。这一发现在人类对遗传现象的理解上具有里程碑的意义，也为孟德尔遗传定律找到了理论解释。,1.,2,克隆技术的创立,1928年，,Hans,Spermann,在蜥蜴上完成了人类历史上第一次核移植实验。他首先用一根头发把一个新受精卵勒住，将细胞核、细胞质各分一边，两部分之间的没有任何交流。拥有核有一半继续分裂增殖，等到16-细胞期时，松开头发套，让其中一个卵裂球细胞的核流入另一侧细胞质中。最后再把这两部分分开。结果发现，这个新建的细胞还能进一步发育成胚胎。这说明早期胚胎卵裂球细胞中，仍拥有全部的遗传信息，每个细胞都有指导发育成新个体的潜能。,1938年，,Hans,Spermann,提出了克隆动物的设想：从一个分化细胞中提取细胞核，然后注入另一个去核的受精卵中构建新胚胎，他同时提出用体细胞进行动物克隆的思想，但一直未能付诸实施。,在此期间，1944年，,Oswald Avery,在研究细菌转化现象时，发现遗传信息存在于核酸中，而当时人们普遍认为遗传信息存在于蛋白质上。这一发现对整个生物科学，特别是细胞核移植研究产生了巨大影响。,1.,3,与克隆技术有关的重大成果,1952年，,Robert Briggs,和,Thomas J.King,用核移植方法克隆出了北美豹蛙的蝌蚪。,1953年，英国生物物理学家,Francis Crick,和美国生化学家,James Watson,共同发现了,DNA,结构。,1958年，,Cornell,大学生物学家,F.E.Steward,成功的用一个胡萝卜细胞培育出了完整的植株。证明植物细胞的全能性。,1961年，,Francis Crick,和,Sidney Brenner,发现，每三个核苷酸碱基序列组成一个密码，特异的针对一个氨基酸。这一成果敲开了现代遗传学的开门。,1962年，,Oxford,大学生物学家,John Gurdon,宣布用已完全分化的南美青蛙蝌蚪的肠细胞核克隆出完整个体，后来又从成年蛙的皮肤角质细胞克隆出了蝌蚪。,1979年，德国生物学家,Karl,Illmensee,宣布成功的克隆出了3只小鼠。,1984年，丹麦科学家,Steen,Willadsen,成功的获得了第一例胚细胞克隆绵羊。,1986年，,Wisconsin,大学的,Neal First,和,Randal Prather,等获得胚细胞克隆牛的成功。,此后，胚细胞克隆兔（,Stice,1988;,黄少华，1993；王斌，1995），大鼠（,Kono,1988），,猪（,Prather,1989；,赵浩斌，1997），山羊（张涌，1991），牛（李雪峰，1996），猴（,Meng，1997）,等相继取得成功。,1991年，,Westhusin,等首先报道继代克隆胚胎可以正常发育到囊胚。1993年，,Stice,和,Keefer,获得了第一、第二、第三代继代克隆牛的出生。1995年，成勇等获得第二代克隆山羊。1998年张涌等报道了第一至第五代克隆山羊的成功。1995年，,Roslin,Ian,研究所的,Wilmut,Keith,和,Campbell,用培养的胚盘细胞成功的克隆出了两只绵羊，表明已经有组织分化的细胞仍具有发育的全能性。1996年，,Wilmut,和,Campell,等成功地从培养的绵羊乳腺细胞得到第一只成年体细胞克隆羊（,Dolly）。,随后几年间，体细胞克隆牛（,Kono,1998;Wells,1999），,小鼠（,Wakayama,1998）,猪（,Onishi,2000），,山羊（张涌等，2000）等相继成功。,History of Nuclear Transfer,Wakayama et al.1998,Shin et al.2002,Meng et al.1997,Baguisi et al.1999,goat,Polejaeva et al.2000,Chesne et al.2002,供核动物,早期胚胎,分割胚,胚胎分割,胚胎干细胞,分离与克隆,胚胎干细,胞核移植,胚胎,干细胞,胚胎细胞核移植,胚胎,细胞,胎儿成纤维,细胞核移植,胎儿成纤维细胞,分离、传代培养,与诱导归零,体细胞分离、,传代培养与诱导归零,体细胞核移植,供卵动物,去核,去核卵母细胞,卵母细胞,重组胚胎体外培养,重组胚胎,核移植,图,1,不同类型克隆动物制作技术路线示意图,克隆胚胎移植,胚胎移植,受体动物,克隆动物,2 动物克隆技术程序,2.1 供核细胞的选择和处理,2.1.1 胚胎卵裂球作为核供体,原 理：早期胚胎卵裂球细胞是全能性的，是一种未分化的细胞。,面对问题：供核细胞如何选择？,解决途径：一般选择桑椹胚前的细胞或后期胚胎中的内细胞团(,inner cell mass),面对问题：如何协调卵母细胞质与植入的细胞核之间的相互作用？,解决途径：研究发现，与卵母细胞周期处于同一时期的核能更好的实现再程序化(,reprogramming)。,早期胚胎的卵裂球细胞可能处于各种时期，因此可用一些化学试剂对胚胎细胞进行诱导，而使它们的周期同步化。,方法一：,M,期同步法。常用噻氨酯达唑（,nocodazole,）、,乙酰甲基秋水仙碱（,colcemid,）。,方法二：,G1,期同步法。阿菲迪霉素（,aphidicolin,）,和羟基脲(,hydroxyurea,)。,可使胚胎细胞分裂停止在,G1/S,转折期。,方法三：,G2,期同步法。放线菌酮（,cycloheximide，CHX）、6-,甲基氨基嘌呤（6-,dimethylaaminopurine，DMAP,）。,2.1.2,胚胎干细胞作为核供体,胚胎干细胞（,embryonic stem cell,ES）,来源于早期胚胎内细胞团，具有与内细胞团细胞相同的发育潜能和正常核型，又可以在体外增殖。,面对问题：,ES,细胞系的建立。,研究现状：小鼠上已建立起,ES,细胞系，并有传代至12代的仔鼠产生（,Nagy,1993），,但在家畜上至今尚未有真正的,ES,细胞核移植体系建立。在猪（,Gerfen,1995）、,绵羊（,Wells,1995）、,牛(,Saito,1992),及灵长类(,Thopmsom，1995),上已有,ES,样细胞系的建立。,2.1.3 体细胞作为核供体,面对问题：供体细胞与受体细胞的周期同步化。,对于给定的卵母细胞周期，只有处在正确周期状态的供体细胞，才有可能进行发育。以常用的,M,期卵母细胞为例，如果将处于,G1,期供体细胞核进入其中后，在,MPF,作用下，发生核膜破裂（,nuclear,evenlop,breakdown,NEBD）、,染色体超前浓缩（,premature chromosome condensation，PCC）、,核膜重新出现和类原核的形成（,pronulcear,formation,PN）,等现象。核重建后仍为2倍体，能够进行正常的,DNA,合成及细胞分裂；如果移入的供体细胞核处,于,G2,期，上述现象仍发生，但由于,G2,期核为4倍体，因此无法正常发育；处于,S,期的供体细胞核进入卵母细胞后，由于染色体倍型紊乱，也不能进行后续的发育。,解决途径：1.血清饥饿法。2.某些化学试剂处理。如阿菲迪霉素（,aphidicolin,）、,丁酸内酯-(,butyrolactone,-)。,可以使大部分细胞阻滞于,G1/S,期。,影响因素：除了周期状态对供体细胞的核移植效果影响外，源于同一原代细胞的亚克隆系细胞之间，也因细胞基因的甲基化情况、乙酰化情况，染色体的完整性，细胞周期等不同，重构胚的发育能力也不同。另外，细胞类型不同，核移植成功率也存在差异。,2.2 受体胞质的选择和处理,2.2.1 卵母细胞在动物克隆中的作用,在克隆中，供核细胞的全能性是基础，但这种全能性只有在特定的条件下才能实现。这一特定条件就是卵母细胞。研究发现：早期胚胎的发育首先是由母型信息调控（,maternal regulation）,的，直到合子型基因被激活，才能过渡到合子型调控（,zogotic,regulation）。,也就是要经过由母源控制向合子型控制胚胎发育的转变（,maternal-zygotic transition,MZT）。,2.2.2,卵母细胞的成熟及生物调控,。,卵母细胞中的,RNA,合成。,卵母细胞中的蛋白质合成。,卵母细胞成熟分裂能力的获得。,卵母细胞成熟分裂的阻滞。,卵母细胞成熟分裂的启动。,卵母细胞成熟分裂的调控。,2.2.3 胞质成熟,在核成熟过程中，胞质中也发生一些非常重要的事件，以满足合子的正常发育，这一过程称之为胞质成熟（,cytoplasmic,maturation）。,包括蛋白质的合成及磷酸化、能量代谢机制的发育和激活等。,2.2.4 卵母细胞的体外培养,2.2.4.1 卵母细胞的获取,途径一：通过超数排卵收集活体动物的成熟卵母细胞。,途径二：通过体外成熟培养获得卵母细胞。,2.2.4.2 卵母细胞成熟培养液,常用的是,TCM199+,动物血清+,FSH/LH+E,2,。,随着研究的深入，不断有新的改良方法出现。,2.2.4.3 卵母细胞成熟的标志,目前一般以排出第一极体作为卵母细胞成熟的标志。,2.2.5 卵母细胞的激活,成熟后的卵母细胞停滞于,M,期，自然条件下，当精子穿入（受精）后会激活卵母细胞，启动一系列生化事件和形态变化。,面对问题：核移植胚是怎样被激活的？,解决途径：,途径一：电激活。电脉冲剌激是最经典、应用最为广泛的卵母细胞激活方式。细胞膜在瞬间高压电流脉冲的作用下，激发穿孔，从而使细胞内外的离子和大分子物质发生短暂流动，其中钙离子的内流会导致卵母细胞活化。,途径二：化学物质激活。包括乙醇、钙离子载体,A23187（Calcium,ionophore,A23187,CaA,）、,离子霉素（,Ionomycin）、Sr,2+,、Thimerosal(THI)、,Dithiothreitol(DTT,)、,三磷酸肌醇、精子因子（,sperm factor,SF）（,精子的提取物）。,2.2.6 卵母细胞去核,卵母细胞去核成功与否是核移植的重要环节。目前最常用的是通过显微操作去核，另外还有化学试剂诱导去核法、高速离心去核法、紫外线或激光照射使染色体失活去核法等。,2.2.6.1 显微操作去核法,方法一：,McGrath,