高效液相色谱介绍和应用优选ppt资料

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱(s p)介绍和应用,第一页，共46页。,高效液相法色谱(s p)简介,第二页，共46页。,高效(o xio)液相色谱法的发展,高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)起始于60年代后期，是在经典液相色谱法的基础(jch)上引入了气相色谱理论而迅速发展起来的一种分离分析方法。,第三页，共46页。,HPLC法的分离(fnl)原理,溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，与固定相(stationary phase)发生吸附、分配、离子交换(l z jio hun)、排阻等作用，由于不同组分理化性质不同，与固定相发生作用的大小、强弱不同，导致在固定相中滞留时间不同，从而先后流出色谱柱。,第四页，共46页。,高效液相色谱仪的结构(jigu)流程,高,压,泵,进,样,器,检,测,器,色谱(s p),工作站,色谱(s p)柱,第五页，共46页。,高效(o xio)液相谱系统,第六页，共46页。,输液泵,输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。输液泵应具备如下性能：流量稳定，其RSD应0.5%；流量范围宽，分析型应在0.110 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；输出压力高，一般(ybn)应能达到150300kg/cm2；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。,第七页，共46页。,一个输液泵只能控制一个输液瓶，即只能用一种溶剂（单一或混合溶剂）进行洗脱（等度洗脱）。由于等度洗脱用的流动相组成始终保持恒定，所以只适合组分数目(shm)少，性质差别不大的样本的分离。,一元(y yun)泵系统,第八页，共46页。,对于组分多、性质差别大的复杂样本在一个条件下难以将各个组分洗脱下来，如在一个分析(fnx)周期内按程序改变流动相的组成（如极性、离子强度和pH值)，使各组分在适当条件下得到分离。,二元泵系统(xtng),第九页，共46页。,在一个分析周期内依据被测组分的极性而按程序改变流动相组成进行洗脱的方法叫做梯度洗脱。,优点：能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形。,缺点：基线漂移。在不同仪器或色谱(s p)柱上较难重现。,第十页，共46页。,高压/低压(dy)梯度洗脱系统及特点,由两台以上输液泵将两种以上溶剂(rngj)分别送入混合器混合，然后进入色谱柱的洗脱方式称为高压梯度洗脱。特点：梯度准确度好。,由一台输液泵通过比例阀和在线脱气机完成的梯度洗脱方法称为低压梯度洗脱。特点：需要配备在线脱气机，易发生时间滞后效应。,第十一页，共46页。,现在的HPLC输液泵多用柱塞往复泵，它的液缸容积可小至0.1ml，易于清洗和更换流动相，特别适合于梯度洗脱，而且由于改变电机转速就能方便地调节流量，所以流量不受柱阻影响，输液泵压力可达400kg/cm2。其主要缺点(qudin)是输出的脉冲性较大，双泵系统较好地克服了输出脉冲性较大的缺点(qudin)。,第十二页，共46页。,按双泵的连接方式可分为并联(bnglin)式和串联式，一般说来并联(bnglin)泵的流量重现性较好（RSD为0.1%左右，串联泵为0.20.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。,第十三页，共46页。,溶剂的纯度要高，否则重现性差；梯度混合的溶剂互溶性要好；进样之前必须进行空白梯度洗脱(x tu)，以辨认溶剂峰；每次梯度洗脱(x tu)之后要对色谱柱进行充分的平衡，使之回到流动相组成的初始浓度。,示差折光检测器对流动相组成变化敏感，不能进行梯度系统。,梯度(t d)洗脱注意事项,第十四页，共46页。,检测器,检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变(zhunbin)为电信号。根据检测原理可将其分为选择性检测器和通用型检测器。,第十五页，共46页。,第十六页，共46页。,几种常用检测器的主要(zhyo)性能,UV,荧光,电化学,质谱,蒸发光,信号,流速影响,温度影响,检测限,(g/ml),池体积,(l),梯度洗脱,样品破坏,吸光度,无,小,10,-10,210,适宜,无,荧光强度,无,小,10,-13,27,适宜,无,电流,有,大,10,-13,1,不宜,无,离子流强度,无,适宜,有,散射光强,无,小,10,-9,适宜,无,第十七页，共46页。,检测器的保养(boyng),紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时打开检测器，20分钟后可以进行检测；在分析完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关(kigun)灯会缩短灯的使用寿命）,样品池要常清洗,第十八页，共46页。,柱温箱,HPLC分析一般在室温条件下进行,但适当提高柱温能降低流动相黏度和柱前压，有利于改善传质和提高分析速度，有利于提高保留时间(shjin)的重现性。,第十九页，共46页。,高效(o xio)液相色谱分类方法与特点,第二十页，共46页。,HPLC 分类(fn li),根据(gnj)固定相可以分为：液-固色谱、液-液色谱及键合相色谱；,根据(gnj)分离原理可以分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、离子对色谱、排阻色谱等。,第二十一页，共46页。,键合相色谱,分离原理：认为吸附、分配(fnpi)兼有之。,正相色谱：采用极性固定相（如硅胶、氨基与腈基键合相），流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。,第二十二页，共46页。,反相色谱：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用(shyng)于分离非极性和极性较弱的化合物。,第二十三页，共46页。,离子交换色谱：固定相是离子交换树脂。缓冲液常用作离子交换色谱的流动(lidng)相。主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。,改变流动(lidng)相的pH值和离子强度可以改善分离。,第二十四页，共46页。,排阻色谱法固定相为有一定孔径的多孔性填料。常用(chn yn)于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。,第二十五页，共46页。,离子对色谱法主要用于分析离子强度大的酸碱物质(wzh)。,分析碱性物质(wzh)常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。,分析酸性物质(wzh)常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。,第二十六页，共46页。,反相离子对色谱法常用ODS柱，流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保留时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度(qingd)有关。,第二十七页，共46页。,三、HPLC使用(shyng)注意事项,第二十八页，共46页。,HPLC的日常操作(cozu)条件,最好是恒温、恒湿,温度：1530,相对湿度80%,房间应有(yn yu)良好的通风,空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器,避免光线直射,远离高电干扰、高振动设备,第二十九页，共46页。,（一）启动(qdng)前检查,1.流动相是否过滤,2.水与有机溶剂混合时温度(wnd)变化大，必须待恢复到室温时方可使用，否则易产生气泡。,3.更换流动相时注意两种流动相必须具有互溶性，,第三十页，共46页。,更换溶剂的一般方法：（1）取少量准备更换的流动相放在清洁的烧杯中，取出吸滤器(lq)，将吸滤头放在烧杯中用超声波振荡器振动清洗干净；,（2）打开排液阀，按清洗键（purge），用新流动相清洗泵中的流动相；,（3）关闭排液阀，启动泵，清洗流路；,（4）连接色谱柱和检测器，用新流动相平衡色谱柱。,第三十一页，共46页。,4.更换不互溶性流动相时应先用异丙醇进行置换，然后每步都按（1）（4）进行。,5.更换缓冲盐流动相时，用纯水清洗(qngx)，每步都按14进行。,6.保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洗(qngx)；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。,第三十二页，共46页。,7.定期在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，保持过滤器畅通无阻。,8.每天开始使用(shyng)仪器时注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。,第三十三页，共46页。,（二）泵的使用(shyng)与维护注意事项,1.防止任何固体微粒进入泵体（0.2um或0.45um的微孔滤膜过滤）。,2.流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性。,3.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内。,4.泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转(ynzhun)会磨损柱塞、密封圈，导致漏液。,第三十四页，共46页。,5.输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形造成漏液。,6.使用缓冲液后用两通管连接(linji)管路及检测池，先用纯水冲洗，然后用甲醇冲洗。管路及检测池冲洗干净后再冲洗色谱柱。,反相柱先用含5%7%甲醇的水冲洗色谱柱（此时不要再连接(linji)检测池），然后用甲醇或甲醇-水混合液冲洗。,第三十五页，共46页。,7.缓冲盐不得在色谱柱中过夜。,8.缓冲液使用前必须(bx)过滤。,9.磷酸盐、乙酸盐缓冲液易受到细菌和霉菌的影响，不得放置过夜，应临用现制。,注意：用缓冲液后不能直接换用有机溶剂,第三十六页，共46页。,LC-10AD:,高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。,与检测器相匹配（质谱、ELSD不能用无机盐缓冲液、用UV检测器时注意溶剂(rngj)的截止波长,不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液,对于组分多、性质差别大的复杂样本在一个条件下难以将各个组分洗脱下来，如在一个分析(fnx)周期内按程序改变流动相的组成（如极性、离子强度和pH值)，使各组分在适当条件下得到分离。,缓冲液常用作离子交换色谱的流动(lidng)相。,第四十一页，共46页。,高效(o xio)液相谱系统,4）常用密封垫的材质适用pH10,样品溶液pH小于10,换特氟隆材质的密封垫pH10-13,磷酸盐、乙酸盐缓冲液易受到细菌和霉菌的影响，不得放置过夜，应临用现制。,第三十二页，共46页。,用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。,在不同仪器或色谱(s p)柱上较难重现。,相对湿度80%,装色谱柱时应按色谱柱上的箭头方向(fngxing)安装。,当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存,流动(lidng)相的贮存,流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能贮存在塑料容器中。,容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化(binhu)，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。,容器应定期清洗，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。,第三十七页，共46页。,1.使用流动相溶解样品,-减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要,-保证(bozhng)样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀,2.进样前最好使用0.45um 的膜进行过滤。,样品(yngpn)处理,第三十八页，共46页。,手动进样阀,操作注意点：,1）样品溶液必须用0.45um的滤膜过滤,2）进样应使用液相色谱专用平头(pngtu)进样针,3）转动阀芯时不能太慢，更不能停留在进样阀的中间位置,4）常用密封垫的材质适用pH10,样品溶液p