实验二微生物培养基的配制和灭菌

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实 验 二,微生物培养基的配制和灭菌,一、实 验 目 的,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。,掌握加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。,（一）培养基的配制,二,.,实 验 原 理,1.,培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。不同微生物对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的,pH,值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。,培养基按成分可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基；按物理状态可分为固体培养基、半固体培养基（,0.2%,0.5%,的琼脂）和液体培养基；按用途可分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等,。,培养基,是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。,培养基简介,碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,营养物质的浓度要适宜,营养物质之间的配比要适宜,培养基的,pH,值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件要适宜。,细菌：,pH 7.08.0,放线菌：,pH 7.58.5,酵母菌：,pH 3.86.0,霉菌：,pH 4.05.8,藻类：,pH 6.07.0,原生动物：,pH 6.08.0,初始,pH,通常培养条件：,培养基的种类,按照培养基的物理状态可分为,1.,液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。,2.,固体培养基：在液体培养基中加入,2%,左右的凝固剂的固体状态的培养基。,3.,半固体培养基：在液体培养基中加入,0.2,0.5%,凝固剂而成的半固体状培养基。,琼脂是最优良的凝固剂，自,1880,年开始用于配制微生物培养基以来，至今经久不衰。,实验室的常用培养基：,细菌：牛肉膏蛋白胨培养基,；,放线菌：高氏,1,号合成培养基培养；,酵母菌：麦芽汁培养基；,霉菌：查氏合成培养基；,称量,-,配置,-,调节,pH,值,-,过滤,-,分装,-,灭菌,1.,称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。,培养基配制的基本步骤,2.,配调 向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。,如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时,，,需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。,如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。,3.,调节,pH,值 培养基溶解均匀并冷却至室温时用,pH,试纸测,pH,，,然后根据要求加酸或碱（一般用,1molHcl,和,1molNaOH,），,要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然,pH,时，不用调节。,4.,过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。,5.,分装 将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。,分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：（,1,）斜面：装量为管长的,1/4-1/5,。（,2,）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的,1/3,。（,3,）三角瓶：装量不超过容积,1/2,。,6.,灭菌 塞棉塞，包扎，灭菌。高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于,100,度的蒸汽温度。,牛肉膏蛋白胨,固体,培养基配方：,牛肉膏,0.3g,蛋白胨,1g,氯化钠,0.5g,琼脂,2g,水,100mL pH 7.27.4,灭菌,121,，,20min,牛肉膏蛋白胨,半固体,培养基配方：,琼脂,0.3g,牛肉膏蛋白胨,液体,培养基配方：,琼脂,0g,牛肉膏蛋白胨培养基的配制,1,、固体培养基（平板制作）,2,、固体培养基（斜面制作）,2,、半固体培养基,3,、液体培养基,三,.,操作步骤及本次实验具体安排,（一）平板固体培养基制作,1.,按配方称取各组分,(,按,100ml,计算,),到的三角瓶中,.,2.,加入,100mL,水,.,3.,在酒精灯上完全融化，,取部分制作斜面培养基,3.,其余部分塞上硅胶塞,用牛皮纸包扎好,;,4.,高压蒸汽灭菌,5.,灭菌后,当培养基冷却至,50,左右时,倾注平皿,(,每,100ml,可制备,5-6,个平皿,),6.,凝固后放冰箱备用,（二）斜面培养基制作,1.,在空试管内倒入,2,3mL,上述已经溶解好的培养基，,【,注意尽量不要让培养基沾到试管口,】,塞好硅胶塞,.,2.,放入烧杯中,高压蒸汽灭菌,.,3.,摆斜面,凝固后放冰箱备用,.,用于活化菌种，,或培养菌种的斜面,用于保存菌种的斜面,搁置斜面,当培养基冷却至,50,左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。,（三）液体培养基制作,1.,按牛肉膏蛋白胨液体培养基配方称取相应成分到,250ml,的三角瓶中,.,2.,加入,100mL,水,.,3.,充分溶解,.,（取出,50ml,用于半固体培养基制作）,4.,在空试管内倒入,2,3mL,已经溶解好的培养基，,【,注意尽量不要让培养基沾到试管口,】,塞好硅胶塞,.,5.,放入烧杯中,高压蒸汽灭菌,.,6.,冷却后放冰箱备用,.,牛肉膏蛋白胨液体体培养基,按下列配方及方法配制,牛肉膏,:0.3g,蛋白胨,:1g,NaCl,:0.5g,水,:100ml,pH:,7.0-7.2,放入水浴锅内溶解后,分装到试管中,灭菌备用,.,（三）半固体培养基制作,1.,在,25ml,液体培养基中加入,0.3%,的琼脂粉,3.,完全溶解,.,4.,在空试管内倒入,2,3mL,已经溶解好的培养基，,【,注意尽量不要让培养基沾到试管口,】,塞好硅胶塞,.,5.,放入烧杯中,高压蒸汽灭菌,.,6.,凝固后放冰箱备用,.,牛肉膏蛋白胨半固体培养基,按下列配方及方法配制,牛肉膏,:0.3g,蛋白胨,:1g,NaCl,:0.5g,琼脂,:0.3g,水,:100ml,pH:,7.0-7.2,放入水浴锅内溶解后,分装到试管中,灭菌备用,.,注：试管加棉塞,(,最好,),培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的,2/3,在试管口内，如下图所示,。,配制好后，写好培养基名称、班级、组别，再灭菌,每组留部分同学等灭菌结束之后，倒固体平板和摆斜面,任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。,常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。,本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，它是利用高温湿热空气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。,（二）培养基的灭菌,高压蒸气灭菌,一般培养基,:,1.05 Kg/cm,2,121.3,15-30 min,含糖培养基,:,0.56 Kg/cm,2,112.6,15-30 min,培养基的灭菌,器皿的灭菌：,干热空气：,160,，,2,小时,无菌室的消毒：,紫外光,化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾,+,甲醛）,灭菌锅,湿热灭菌使用的设备,操作过程,加水,装锅,盖盖,加热,当压力升为,0.5kg/cm2,时排放冷空气,正式升压,保压（,1.1kg/cm2,，,121,，保持,20-30min,）,停止加热,自然降压至零,排放余汽,开盖,取出灭菌物品,趁热摆斜面,检验灭菌效果。,本次实验报告内容,记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。,思考题,培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌,?,若不能及时灭菌应如何处理,?,已灭菌的培养基如何进行无菌检查,?,