染色质免疫沉淀

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2012/10/13,#,染色质免疫,(miny),共沉淀,(ChIP),第一页，共十八页。,目录,(ml),简介,技术原理,技术流程,应用,优缺点,第二页，共十八页。,一、简介,(jin ji),DNA,与蛋白质相互作用研究,(ynji),DNase,足纹法,电泳迁移率变动分析,生物信息学方法,酵母单杂交系统,ChIP,第三页，共十八页。,一、简介,(jin ji),ChIP,是目前唯一研究体内,DNA,与蛋白质相互作用的方法,(fngf),。不仅可以检测体内反式因子与,DNA,的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。,第四页，共十八页。,二、原理,(yunl),在活细胞状态,(zhungti),下固定蛋白质,DNA,复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的,DNA,片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与,DNA,相互作用的信息。,第五页，共十八页。,三、技术,(jsh),流程,具体操作流程,(lichng),DNA,分析,第六页，共十八页。,1,、甲醛,(ji qun),交联细胞,具,体,步,骤,10,ml1PBS,孵育,8min,弃上清,4-5ml,预,冷,1 PBS,预冷,1PBS,洗涤两次,转移,4000rpm,离心,5min,弃上清,1ml,预冷,1PBS,悬浮,新离心管,4000rpm,离心,5min,1ml1,.,25mol/L,甘氨酸,室温,10-20min,第七页，共十八页。,2,、染色质超声断裂,(dun li),1.,加,SDS,裂解溶液重悬浮沉淀，冰上,10min,.,每,1min,颠倒摇动一次离心管。,2.,把,DNA,粉碎,(fn su),为长度,200-1000bp,，置于冰上。不同样本都进行超声条件优化实验。,3.,14000rpm,离心,10min,（,4,）,，转移,上清于,1.5ml,离心管。,第八页，共十八页。,3.,免疫沉淀蛋白,(dnbi),和,DNA,复合物,超声染色质液体,2ml,超声稀释液,4,摇床摇动一小时,1000rmp,离心,2min,（,4,）,转移上清液至新离心管,ChIP,稀释液稀释,10,倍,加入,20l,蛋白,A/G,琼脂糖珠,1-4l,免疫沉淀抗体,取,50l,上清液作为对照,？,？,第九页，共十八页。,4,、收获,(shuhu),免疫复合物（抗体,-,蛋白质,-DNA,）,样品,摇动,1-2h,，,4,40lProtein A/G Agarose Beads,1PBS,洗,3,次离心,1000rpm,1min.,弃上清，用,4l 1PBS,悬浮,1000rpm,离心,(lxn),5min,4,a,低盐洗脱,(x tu),溶液,1ml,洗一次,b,高盐洗脱溶液,1ml,洗一次,c,氯化锂洗脱溶液,1ml,洗一次,d TE,溶液,(pH8.0)1ml,洗两次,每次洗时，在摇床上摇,10min,4,，,4000rpm,离心,5min,弃上清,第十页，共十八页。,5,、洗,脱,脱,(x,tu,),免疫,复,复合,物,物,Beads,200lChIP,洗脱溶液洗脱,摇床上摇动,10min,12000rpm,离心,1min,取上清,Beads,取上清,200l,ChIP,洗脱溶液,(3,次,),600l,洗脱液,第十一页,，,，共十八,页,页。,6,、去除甲,醛,醛交联,加,5mlNaCl,使用,NaCl,终浓度为,0.2mol/l,阴性对,照,照,+350,lChIP,洗脱,(xtu),溶液,+16l5mol/l NaCl,。,65,过夜,去交联。,第十二页,，,，共十八,页,页。,7,、,DNA,纯化,(chn hu,),酚,/,氯仿,(lfn),抽提,实验样本,(600l),50l,阴性对照,10lRNase,50l,蛋白酶,K,等量酚,/,氯仿,/,异戊醇（,25:24:1,）,12000rmp,离心,(lx,n),5min,上清液,上清液,1/10,体积,3mol/l,乙酸钠,2,倍体积冰冻无水乙醇,-80,冰箱,1h.12000rmp,离心,20min,，弃上清,加入,70%,乙醇，悬浮沉淀，,12000rpm,离心,10min,，去上清，,DNA,干燥后，,40lTE,溶解,硅胶柱纯化,第十三页,，,，共十八,页,页。,8,、染色质,免,免疫共沉,淀,淀,DNA,的分析和,蛋,蛋白质在,DNA,上结合,(jih),位点的鉴,定,定,(1),如果目的,蛋,蛋白靶序,列,列已知，,或,或怀疑某,一,一序列是,目,目的蛋白,靶,靶序列，,则,则可选用,定,定量或者,半,半定量,PCR,方法。,(2),如果目的,蛋,蛋白的靶,序,序列未知,或,或者研究,目,目的蛋白,基,基因组分,布,布情况,(qngkung),，找出转,录,录因子结,合,合位点，,则,则可采用,ChIP,克隆测序,，,，,ChIP-chip,，和,ChIP-seq,方法。,第十四页,，,，共十八,页,页。,四、应用,(yngyng),组蛋白修,饰,饰研究,(ynji),转录调控,分,分析,药物开发,研,研究,有丝分裂,研,研究,DNA,损伤与凋,亡,亡分析,第十五页,，,，共十八,页,页。,五、优缺,点,点,优点：充,分,分反映生,理,理条件下,DNA,与蛋白质,相,相互作用,的,的真实情,况,况，可以,找,找出生理,条,条件下某,个,个,DNA,结合蛋白,与,与,DNA,序列的结,合,合位点，,从,从而反映,体,体内基因,表,表达调控,的,的真实情,况,况。,缺点,(qudin),：需要一,个,个特异性,蛋,蛋白质抗,体,体，有时,难,难以获得,；,；为了获,得,得高等丰,度,度的结合,片,片段，必,须,须实验演,示,示胞内条,件,件下靶标,蛋,蛋白质的,表,表达情况,；,；调控蛋,白,白质的基,因,因获取可,能,能需要限,制,制在组织,来,来源。,第十六页,，,，共十八,页,页。,谢谢,(xixie),大家！,第十七页,，,，共十八,页,页。,内容,(nirng),总结,染色质免,疫,疫共沉淀(ChIP)。不,仅,仅可以检,测,测体内反,式,式因子与DNA的,动,动态作用,，,，还可以,用,用来研究,组,组蛋白的,各,各种共价,修,修饰与基,因,因表达,(biod),关系。4-5ml,预,预冷1,PBS。1.,加,加SDS,裂,裂解溶液,重,重悬浮沉,淀,淀，冰上10min.每1min颠,倒,倒摇动一,次,次离心管,。,。4、收,获,获免疫复,合,合物（抗,体,体-蛋白,质,质-DNA）。40lProtein A/G Agarose Beads,。,。每次洗,时,时，在摇,床,床上摇10min,4，4000rpm离,心,心5min。谢谢,大,大家,第十八页,，,，共十八,页,页。,