资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,HPLC的使用、维护及方法学的建立,药剂教研室 马冬冬,HPLC的使用、维护及方法学的建立药剂教研室 马冬冬,2,HPLC,基本原理和特点,液相色谱仪器部件,实验操作与应用,日常维护,方法学的建立,2HPLC基本原理和特点,基本原理和特点,基本原理:溶于流动相,(mobile phase),中的各组分经过固定相时,由于与固定相,(stationary phase),发生作用,(,吸附,,,分配,,,离子吸引,,,排阻,,,亲和,),的大小,,,强弱不同,,,在固定相中滞留时间不同,,,从而先后从固定相中流出,。,特点:分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。,基本原理和特点基本原理:溶于流动相(mobile phase,HPLC的分类,按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法,(NPC),和反相色谱法,(RPC),。,正相色谱法:采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(如正已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物。,反相色谱法,:一般用非极性固定相(如,C18,、,C8,);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂,,极性物质先出,。,HPLC的分类按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(N,高效液相色谱仪组成,输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,数据记录处理系统,高效液相色谱仪组成输液系统,溶剂,色谱泵,自动进样器,HPLC,色谱柱,检测器,废液,数据处理系统,液相色谱流程图,溶剂 色谱泵自动进样器 HPLC色谱柱检测器废液数据处理系统,一些商品化仪器,脱气装置,四元泵,柱温箱,样品盘,检测器,流动相,一些商品化仪器脱气装置四元泵柱温箱样品盘检测器流动相,溶剂,棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。,溶剂棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。经常过滤溶剂以免其中微粒,启动液相色谱仪器的流程,开启,HPLC,系统各个设备的电源,打开泵、自动进样器、检测器电源,打开计算机启动“,1260,联机工作站”,待工作站图形颜色为绿色,表明仪器已就绪。,排气泡,打开排气阀,将流速调至,5ml/min,,排气,5min,;待流速降为,0,,拧紧排气阀。,80%,甲醇(过滤、超声,15min,)冲洗系统,使用,80%,的甲醇溶液冲洗系统至少,30min,,流速为,1ml/min,,待基线平稳即可进行下一步操作。,注意:,观察柱压是否稳定,若不稳定出现大幅度柱压下降现象,很有可能是系统发生漏液,优先排查色谱柱的连接处是否漏液,其次是排气阀处,最后是观察其他管道连接处;若流动相中含有离子,,80%,甲醇冲洗系统之后,使用,10%,甲醇继续冲洗系统至少,30min,。否则,会有离子析出,堵塞管路。,柱压应小于,10bar,,如若过大,应更换溶剂出口过滤白头,启动液相色谱仪器的流程 开启HPLC系统各个设备的电源柱压应,启动液相色谱仪器的流程,流动相冲洗系统,流动相配制后,先使用过滤装置过滤,然后超声,15min,,排除气泡干扰。流速,1ml/min,,使用流动相冲洗系统至少,30min,,待基线平稳即可进行下一步操作。,进样测定,具体操作如下:点击“序列”,-“,序列表”,-,输入相关信息确定(样品瓶、样品名称、方法名称,-TEST,、进样次数、进样量),-“,开始序列”。待进样结束后,进行下一步操作。,注意:,在进样前,最好用,100%,甲醇进行洗针,以防进样针中残留的其它样品影响实验结果。,水相走,A,、,D,泵,有机相走,B,、,C,泵,可防止缓冲盐析出,启动液相色谱仪器的流程 水相走A、D泵,有机相走B、C泵,可,启动液相色谱仪器的流程,80%,甲醇冲洗系统,使用,80%,的甲醇溶液冲洗系统至少,30min,,流速为,1ml/min,,待基线平稳,将流速降为,0,,即可进行下一步操作。,注意:若流动相中含有离子,先使用,10%,甲醇冲洗系统至少,30min,,后使用,80%,甲醇冲洗系统。,关闭系统,点击工作站右下角“关闭”按钮,待仪器显示未就绪,关闭,1260,(联机),关闭电脑,关闭液相各模块电源。拔掉总电源即结束。,启动液相色谱仪器的流程 80%甲醇冲洗系统,流动相的选择,甲醇,质子化溶剂 氢键供给者,洗脱能力较乙腈弱,粘度较乙腈高,低紫外波长下有吸收,乙腈,非质子化溶剂 氢键接受者,洗脱能力较甲醇强,粘度较甲醇低,低紫外波长下透光性好,流动相的选择甲醇,常用溶剂的极性及截止波长,反相,液相色谱,若希望出峰时间早,可以增加流动相中有机相的比例;,若,希望出峰时间晚,,,可以增加流动相中水相比例(有机相一般不低于,5%,),。,甲醇的极限波长为,210,nm,,,因此,检测波长较小时,,,应该选用乙腈而非甲醇;样品稀释最好选用流动相,可以避免溶剂峰的干扰。,溶剂,水,甲醇,乙醇,异丙醇,乙腈,四氢呋喃,极性常数,1.00,0.95,0.88,0.82,0.65,0.57,截止波长,170,210,210,210,190,210,流动相的选择,80%,甲醇冲系统基线不平,常用溶剂的极性及截止波长反相液相色谱,若希望出峰时间早,可以,为了得到较好的分离效果,可以在流动相中加入一些少量的有机溶剂,如三乙胺来调节峰形变“瘦”,减少拖尾现象。,加入缓冲盐,调节流动相的,pH,值或离子强度,以改变组分的保留时间达到分离效果等。,一般情况下,大家如要建立色谱条件,,应先去查询,中国药典,及文献资料,再进行适当的修改。,流动相的调节,为了得到较好的分离效果,可以在流动相中加入一些少量的有机溶剂,过滤:,0.45um,或更小孔径滤膜,目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液。,注意:不同的试剂分别过滤,过滤后再混合;滤膜的选择,不要混用;要现用现处理,尤其是水和缓冲液,脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡,气泡对测定的影响:,泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积,柱中气泡使流动相绕流,峰变形,检测器中的气泡产生基线波动,流动相的处理,过滤:0.45um或更小孔径滤膜流动相的处理,HPLC安捷伦高效液相使用维护常见问题解析ppt课件,流动相的保存,有机溶剂流动相:,室温下密封,避光保存,缓冲盐流动相:,当日现配现用:,低温下密封保存,一般不超过,3,天,防止微生物生长,有机溶剂与水(缓冲盐)混配的流动相:,低温密封保存,防止有机相的挥发,流动相的保存有机溶剂流动相:,梯度洗脱,梯度洗脱是指在一个分析周期中,按一定的程序连续改变流动相中溶剂的组成(如溶剂的极性、离子强度、,pH,值等)和配比,使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离。是分析,复杂混合物,特别是分离保留性能相差较大的混合物的极为重要的手段。,优点,:改善峰形,提高柱效,缩短分析时间,强保留成分不易残留在柱上,缺点,:会引起基线漂移,有时重现性差,故,需严格控制梯度洗脱的实验条件,。,能等度洗脱绝不选择梯度洗脱,梯度洗脱梯度洗脱是指在一个分析周期中,按一定的程序连续改变流,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,进样器,检测器,维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器进样器检测器,检查溶剂过滤器,查看过滤器是否变色,临时取下过滤器,检查柱前压力是否正常,清洁溶剂过滤器,将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂然后将过滤器放在装有,浓硝酸(35),的烧杯里浸一小时,不要使用超声波清洗,用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器,将过滤器重新装好。,建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶,每三个月至少清洗一次。,日常维护,检查溶剂过滤器日常维护,日常维护,严重污染的溶剂出口过滤芯,日常维护严重污染的溶剂出口过滤芯,日常维护,溶剂出口过滤白头,日常维护溶剂出口过滤白头,日常维护,泵的保养:,使用流动相尽量要清洁;,进液处的
展开阅读全文