继续教育cb讲义课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,常规细胞遗传学/,FISH,在白血病诊断分型中的应用,-上海血液学研究所 陈冰,常规细胞遗传学/FISH-上海血液学研究所 陈冰,1,细胞遗传学基础,细胞遗传学基础,2,常见染色体异常数目异常,单倍体：,n,多倍体：,3,n,或4,n,非整倍体：,单体：,monosomy,三体：,trisomy,*,非整倍体：有丝分裂中染色体不分离或染色体丢失,常见染色体异常数目异常单倍体：n,3,常见染色体异常结构异常,缺失：,deletion,重复：,duplication,易位：,translocation,等臂染色体：,isochromosome,常见染色体异常结构异常缺失：重复：易位：等臂染色体：,4,常见染色体异常结构异常,环状染色体：,ring chromosome,标记染色体：,marker chromosome,双着丝粒染色体：,dicentric chromosome,双微体：,double minutes,常见染色体异常结构异常环状染色体：ring chro,5,白血病细胞遗传学研究方法标本来源和采集,骨髓：,3-5ml；,*取自肿瘤组织本身,外周血：,(1)WBC10 x10,9,/L;,(2)原、幼细胞百分比10%,*分裂相均来源于白血病细胞,*无脂肪颗粒，标本质量好,淋巴结：,穿刺液或活检标本,*骨髓浸润时可用骨髓标本,白血病细胞遗传学研究方法标本来源和采集骨髓：3-5m,6,白血病细胞遗传学研究方法染色体制备方法,直接法：,不经培养立即处理,短期培养法：,按1-3x10,6,/ml细胞密度接种到培养基,培养24-48h,同步法：,应用MTX或Fdu处理17h，使其同步化,白血病细胞遗传学研究方法染色体制备方法直接法：不经培养,7,白血病细胞遗传学研究方法染色体显带,Q,带：,荧光很快褪色，标本不易保存,C,带：,染色体着丝粒显带，对染色体识别帮助不大,G,带：,带纹细致，解象力强,末端呈浅带，不利于该区异常的识别,对分裂相数量及质量要求高，条件欠稳定,*,盐水法、碱处理法、尿素法、,蛋白酶消化法,*AT碱基呈深带,R,带：,带型与Q、G带相反,除Y染色体外，末端均呈深带，揭示该区的缺失与易位,方法简便，重复性好，可成批显带,对分裂相量少质差的肿瘤细胞显带成功率高,带纹不如G带精细，难以识别微小异常,*荧光R带、,热处理Giemsa-R显带法,*CG碱基呈深带,白血病细胞遗传学研究方法染色体显带Q带：荧光很快褪色，,8,核型分析,的优缺点:,直观，能同时检测全部染色体数目、结构异常,为形态学检查，灵敏度有限,必须有可分析的中期分裂相，无法分析间期核,核型分析的优缺点:直观，能同时检测全部染色体数目、结构异常,9,染色体荧光原位杂交技术在肿瘤遗传学研究中的应用,染色体荧光原位杂交技术在肿瘤遗传学研究中的应用,10,FISH,的基本原理：,单链DNA（探针）和与其互补的DNA（玻片上的标本）退火杂交,FISH的基本原理：单链DNA（探针）和与其互补的DNA（玻,11,Denature,Hybridization,DenatureHybridization,12,染色体或间期核玻片标本制备,探针制备和标记,玻片标本的变性,探针的变性,原位分子杂交,荧光显微镜观察,FISH,的基本步骤：,染色体或间期核玻片标本制备FISH的基本步骤：,13,染色体或间期核玻片标本制备,直接法制备,短期培养法,72小时培养法,FISH,的基本步骤（1）：,染色体或间期核玻片标本制备FISH的基本步骤（1）：,14,探针制备和标记,标记方法：,间接标记:生物素,地高辛,直接标记：荧光素,FISH,的基本步骤（2）：,探针制备和标记FISH的基本步骤（2）：,15,单一序列基因探针（单标、双标）,染色体着丝粒探针,染色体涂色探针,CGH,M-FISH,Rx-FISH,FISH,探针的选用：,单一序列基因探针（单标、双标）FISH探针的选用：,16,一、经典的,FISH,技术,一、经典的FISH技术,17,白血病的染色体异常：,染色体数目异常的检测,染色体结构异常的检测,易位,倒位,白血病的染色体异常：染色体数目异常的检测,18,FISH,在白血病中的应用:,白血病的,MICM,诊断-常见染色体易位的检测,鉴别标志染色体,发现、确定新的染色体易位，有助于定位克隆新的疾病基因,白血病疗效判断,鉴定,BMT,后造血细胞的克隆起源,白血病预后判断,检测微小残留病和监测早期复发,FISH在白血病中的应用:白血病的MICM诊断-常见染色,19,单一基因探针,单标记,FISH,inv(16)M4Eo,FISH,探针的选用：,单一基因探针FISH探针的选用：,20,单一基因探针,双标记,FISH,t(15;17)M3(APL),t(8;21)M2b,t(9;22)CML,FISH,探针的选用：,单一基因探针FISH探针的选用：,21,染色体着丝粒探针,检测染色体数目异常,染色体定位标记,着丝粒及着丝粒周染色体易位,FISH,探针的选用：,染色体着丝粒探针FISH探针的选用：,22,全染色体涂抹,(Chromosome painting),FISH,探针的选用：,全染色体涂抹FISH探针的选用：,23,FISH,检测,的优点（1）:,直观，是细胞遗传学和分子生物学之间的桥梁,敏感性和特异性高,能分析一部分显带技术不易分辨的异常，如某些倒位、丢失、复杂畸形等,FISH检测的优点（1）:直观，是细胞遗传学和分子生物学之间,24,FISH,检测,的优点（2）:,与细胞形态学结合，有助于深入理解疾病的发病机制,能检测石蜡固定和Rights染色标本,多色FISH可在同一标本上同时检测多种序列。,FISH检测的优点（2）:与细胞形态学结合，有助于深入理解疾,25,FISH,检测,的优点（3）:,间期核,FISH,：,不需体外培养，对非分裂细胞即可快速检测,可对终末分化的细胞进行检测,在极短的时间内可检测大量细胞,FISH检测的优点（3）:间期核FISH：,26,FISH,检测,的缺点（1）:,染色体异常的检测受限于相应探针的获得,对三体检测的敏感性高于对单体或缺失的检测,标本的限制（骨髓、外周血标本优于实体瘤或石蜡包埋、冰冻切片标本）,FISH检测的缺点（1）:染色体异常的检测受限于相应探针的获,27,FISH,检测,的缺点（2）:,需要荧光显微镜和图象分析系统,一次杂交只能检测1至数个异常，不能同时对整个基因组的染色体数目、结构异常进行检测,FISH检测的缺点（2）:需要荧光显微镜和图象分析系统,28,二、,M-FISH（Multiplex-FISH）,SKY,（光谱核型分析）,Combinatorial M-FISH,COBRA M-FISH,二、M-FISH（Multiplex-FISH）Co,29,M-FISH,基本原理（1）,Combinatorial M-FISH,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y,FITC X X X X X X X X X X X,C y3 X X X X X X X X X X,Cy3.5 X X X X X X X X X X X,C y5 X X X X X X X X X X,Cy7 X X X X X X X X X X,M-FISH基本原理（1）Combinatorial M-,30,COBRA M-FISH,Chrom FITC TRITC,1 100 0,2 67 33,3 50 50,4 33 67,5 0 100,M-FISH,基本原理（2）,COBRA M-FISHChrom FITC,31,光谱核型分析,（SKY）,光谱核型分析（SKY）,32,M-FISH,与,SKY,的优点:,一次实验可对整个基因组进行分析,适于检测染色体数目异常及一些结构重排,M-FISH与SKY的优点:一次实验可对整个基因组进行分析,33,三、彩色显带,FISH,Rx-FISH(Cross-Species Colour segmenting in Human Karyotype Analysis),Multicolor Chromosome Bar Code for the Human Karyotype by FISH,High Resolution Multicolor-Banding for Human Chromosome,三、彩色显带FISHRx-FISH(Cross-Spec,34,彩色显带,FISH,的优点:,染色体内的结构异常,臂内、臂间倒位,一定程度的缺失、复制,彩色显带FISH的优点:染色体内的结构异常,35,四、比较基因组杂交,研究肿瘤基因组不平衡性,四、比较基因组杂交研究肿瘤基因组不平衡性,36,Comparative Genomic Hybridization(CGH),DAPI FITC TexasRed Ratio,Comparative Genomic Hybridizat,37,CGH,检测,的优点（1）:,经一次染色体原位杂交实验，即可在整条染色体或染色体区带水平对待检基因组,DNA,序列拷贝数改变进行检测和定位,所需,DNA,标本可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织，甚至单个细胞，故可做回顾性研究,CGH检测的优点（1）:经一次染色体原位杂交实验，即可在整条,38,CGH,检测,的优点（2）:,无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体瘤尤为适用,不需事先了解染色体的结构和可能存在的异常,仅需少量的肿瘤,DNA,（约1,ug,）,CGH检测的优点（2）:无需进行染色体培养，对于不易制备良好,39,CGH,检测,的缺点（1）:,不适用于以下异常的检出：,（1）平衡易位或插入、点突变、倒位、基因内重排,（2）倍体水平的改变,（3）着丝粒旁及染色质，端粒区,CGH检测的缺点（1）:不适用于以下异常的检出：,40,CGH,检测,的缺点（2）:,结果易受以下因素影响：,（1）正常细胞的污染,（2）肿瘤自身的遗传异质性,（3）系统产生的位点特异的不稳定性：,1p23-ter，16p，19，22,CGH检测的缺点（2）:结果易受以下因素影响：,41,CGH,检测,的缺点（3）:,灵敏度的限制：,（1）,DNA,缺失：,10-20,Mb,（细胞株）以上,20-30,Mb,（原发肿瘤）以上,（2）,DNA,扩增：,扩增子与扩增拷贝之积至少2,Mb,CGH检测的缺点（3）:灵敏度的限制：,42,Array-CGH,：,用于检测基因组不平衡性的重要技术，其分辨率比传统的比较基因组杂交,（CGH）,提高了20-100倍，也达到了检测基因拷贝数异常的精确度。,局限性在于无法检测出平衡易位、倒位、插入和复杂核型；不能检测性染色体的不平衡；也无法检测小于其分辨率的基因组不平衡异常。,Array-CGH：用于检测基因组不平衡性的重要技术，其分辨,43,谢谢！,谢谢！,44,