鸡新城疫血凝和血凝抑制实验

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价,目的,1、掌握鸡新城疫的临诊要点。,2、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。,内容,1,、鸡新城疫的临诊要点。,2,、鸡新城疫的实验室诊断。,NDV,的分离及鉴定；,NDV,毒力的鉴定,3,、鸡新城疫的免疫效果评价,鸡新城疫的免疫监测,血凝试验,(HA),和血凝抑制试验,(HI),血凝试验（,HA,）和血凝抑制试验,(HI),HA,和,HI,的原理,HA,试验：,许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受体结,合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象,。,2.HI,试验：,病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称,HI,试验。,一、鸡新城疫的血凝试验,(HA),【材料】,新城疫病毒鸡胚接种尿囊液 1份,0.5鸡血球悬液 1管,生理盐水或,PBS 1,瓶,96孔微量血清盘 1块,微量加样器 1支,一、鸡新城疫的血凝试验,(HA),【,方法与步骤,】,（一）制备鸡红细胞悬液：,1,.用注射器抽取抗凝剂。,2.用上述注射器，采用无菌法抽取健康的未免疫鸡的静脉血。,3.混匀，加生理盐水适量，洗涤离心，共离心三次（第一、二次2000转/分5分钟、第三次3000转/分,5,分钟）洗去血清及白细胞。,取纯红细胞,0.6ml,，加生理盐水稀释,99.4ml,，即成1%的鸡红细胞悬液。,一、鸡新城疫的血凝试验,(HA),（,二）加样,1.,在,96,孔微量反应板上进行，自左至右各孔加,50,L,生理盐水。,2.,于左侧第,1,孔加,50,L,病毒液，混合均匀后，吸,50,L,至第,2,孔，依次倍比稀释至第,11,孔，吸弃,50,L,；第,12,孔为红细胞对照。,3.,自右至左依次向各孔加入,0.5%,鸡红细胞悬液,50,L,，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。,一、鸡新城疫的血凝试验,(HA),【病毒血凝试验的操作方法（单位：,L,）】,孔 号,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,病毒稀释度,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,1:512,1:1024,1:2048,对照,生理盐水,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,病毒液,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,0.6%,红细胞,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,微型振荡器,1min,，静置,30min,弃,50,结果观察,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,以,100%,凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位,一、鸡新城疫的血凝试验,(HA),【,结果判定,】,置于振荡器上振荡1分钟，静置后,30 min,开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为,100%,凝集（,+,），不凝集者（,-,）红细胞沉于孔底呈点状。,以,100%,凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表,4-1,看出，该新城疫病毒液的血凝价为,1:128,，则,l:128,为,1,个血凝单位，,1:64,、,l:32,分别为,2,、,4,个血凝单位，或将,128/4=32,，即,1:32,稀释的病毒液为,4,个血凝单位。,二、鸡新城疫的血凝抑制试验,(HI),【材料】,除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。,鸡群卵黄抗体的制备,1.,取鸡蛋卵黄,20ml,，加入等量生理盐水，振荡，摇匀。,2.,加入等量氯仿,40ml,，振荡,30,分钟。,3.,取振荡的卵黄液,3000,4000rpm30,分钟。,4.,取上清液作为抗体检测材料,二、鸡新城疫的血凝抑制试验,(HI),【方法】,1.,根据,HA,试验结果，确定病毒的血凝价，配制出,4,个血凝单位的病毒液。,2.,在,96,孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第,1,孔加,50,L,生理盐水。,3.,自第,3,孔至,12,孔各加,50,L 4,个血凝单位的新城疫病毒液。,4.,第孔加被检鸡血清,50,L,，吹吸混合均匀，吸,50,L,至第,2,孔，依此倍比稀释至第,10,孔，吸弃,50,L,，稀释度分别为：,1:,、,1:4,、,1:8,；第,12,孔加新城疫阳性血清,50,L,，作为血清对照。振荡混合均匀，置室温中作用,20min,。,5.,自第,l,孔至,12,孔各加,0.5%,鸡红细胞悬液,50,L,，振荡混合均匀，室温下静置,30-40min,后观察结果,二、鸡新城疫的血凝抑制试验,(HI),孔 号,滴度,lg2,材料,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,病,毒对,照,对照,8,单位病毒,50,4,单位病毒,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,生理盐水,50,被检鸡血清,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,弃,50,0.6%,红细胞,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,50,震荡混匀，室温,30-40min,结果观察,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,【,病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：,L,）】,以,100,抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即,HI,效价。,二、鸡新城疫的血凝抑制试验,(HI),【结果判定】,以,100,抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即,HI,效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。,从表,4-2,看出，该血清的,HI,效价为,1:64,，用以,2,为底的负对数,(-log2),表示，即,6log2,。,