FISH技术在血液肿瘤中的应用课件

,#,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,FISH,技术在血液肿瘤中的应用,FISH技术在血液肿瘤中的应用,FISH,-,目前新兴的,分子遗传学技术,，原理是,采用荧光标记的,DNA,探针,，利用探针与检测样本中,DNA,碱基对的互补性，在探针与标本的,DNA,杂交后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞、组织样本中的染色体和基因异常。,荧光原位杂交,Fluorescence In Situ Hybridization,FISH,探针,DNA,加入荧光标记,解螺旋，杂交,2,FISH-目前新兴的分子遗传学技术，原理是采用荧光标记的DN,样本预处理,探针、样本变性,探针样本杂交,杂交后洗涤,结果观察,FISH,基本实验过程,3,样本预处理FISH基本实验过程3,FISH,探针种类,根据标记颜色的不同，常用探针主要有：,单色探针,（,single color probe,SC,）,双色探针,（,dual color probe,DC,）,三色探针,（,triple color probe,TC,）,双色分离探针,（,dual color,break apart probe,DC,BCR,）,双色单融合探针,（,dual color,single fusion probe,DC,SF Trans,）,额外信号探针,（,extra signal,ES,）,双色双融合探针,（,dual color,dual fusion probe,DC,DF Trans,）,4,FISH探针种类根据标记颜色的不同，常用探针主要有：4,单色探针,（,SC,）：,双色探针,（,DC,）：,三色探针,（,TC,）：,D7S486,CEP7,CEP18,Y,X,正常,正常,正常,异常,异常,异常,5,D7S486CEP7CEP18YX正常正常正常异常异常异常5,FISH,技术的应用,FISH,检测在临床上主要应用于：,血液系统疾病：白血病、,MDS,、,MM,等；,实体瘤：乳腺癌、膀胱癌等；,产前遗传筛查：唐氏综合症（,21,三体）等,临床意义：,从遗传学角度检测,染色体和基因,的异常,辅助诊断，判断预后，疗效检测及微小残留检测,6,FISH技术的应用FISH检测在临床上主要应用于：6,FISH,技术在血液肿瘤中的应用,血液系统肿瘤是我国十大高发肿瘤之一。大量研究表明，不同类型的,血液肿瘤往往有其特异的染色体异常,，对肿瘤分型、诊断、治疗和预测用预后都具有重要意义。常规细胞遗传学分析（,CC,）方法只能分析中期染色体，而对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。,FISH,技术弥补了,CC,在这方面的不足，因此被广泛应用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。,FAB,分型,细胞遗传学异常,分子异常,M0,核型异常常见且复杂，常累及,5,、,7,、,8,和,13,染色体,M1,t(9;22),inv(3),M2,t(8;21),t(6;9),t(12p),AML1-ETO,M3,t(15;17),PML-RARA,M4,+4,11q23,重排，,M4Eo inv(16)/t(16;16),MLL-AF9,M5,t(11q),t(8;16),Pre-B/B-ALL(L1/L2),t(9;22)(q34;q11),BCR-ABL,B-ALL(L3),t(8;14)(q24;q32),MYC-IGH,白血病的细胞遗传学异常,7,FISH技术在血液肿瘤中的应用 血液系,血液肿瘤的,FISH,检测,临床上对血液肿瘤的,FISH,检测主要集中在以下几个方面：,染色体易位形成的融合基因检测,：,如,CML,的,BCR-ABL,、,M3,的,PML-RARA,、,M2b,的,AML1-ETO,融合基因等；,基因缺失检测：,如,CLL,的,P53,基因缺失提示患者预后很差，而,13q,单一缺失则提示预后较好；,对异性间造血干细胞移植的植入状态检测：,通过性染色体计数探针动态监测供,/,受者混合性嵌合体比例变化对异性间异基因造血干细胞移植后植入状态进行监测；,微小残留病灶（,MRD,）的检测：,通过对肿瘤细胞特异的染色体异常进行跟踪监测，预测疾病进展和有无复发迹象。,8,血液肿瘤的FISH检测临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中,血液肿瘤荧光原位杂交探针,疾病名称,探针名称,浆细胞疾病,多发性骨髓瘤（,MM,）,GLP P53,，,GLP RB1,，,GLP D13S319 GLP IGH,，,GLP 1q21,白,血,病,慢性淋巴细胞白血病（,CLL,）,GLP P53 GLP RB1 GLP D13S25 GLP ATM CSP 12,慢性粒细胞白血病（,CML,）,GLP BCR/GLP ABL,；,GLP ASS,急性早幼粒细胞白血病（,AML-M3,）,GLP PML/GLP RARA,急性原始粒细胞白血病部分分化型（,AML-,M2,）,GLP AML1/GLP ETO,粒单核细胞白血病,(AML-M4),GLP CBFB,小儿急性淋巴细胞白血病（,ALL,）,GLP 4/10,GLP 17,GLP BCR/GLP ABL,GLP MLL GLP TEL/AML1,MDS,骨髓增生异常综合症,GLP CSF1R/GLP D5S23,，,D5S721GLP EGR1/GLP D5S23,，,D5S721GLP D7S486/CSP7;GLP D7S522/CSP7;,GLP D20S108/CSP8;CSP X/CSP Y,；,性染色体错配骨髓移植,CSP X/CSP Y,淋,巴,瘤,B,细胞淋巴瘤,GLP IGH,滤泡性淋巴瘤（,FL,）,GLP IGH/GLP BCL2,套细胞淋巴瘤（,MCL,）,GLP IGH/GLP CCND1,弥漫性大,B,细胞淋巴瘤（,DLBCL,）,GLP BCL6,伯基特淋巴瘤（,BL,）,GLP C-MYC,粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（,MALT,）,GLP MALT1,GLP MALT1/GLP API2,9,血液肿瘤荧光原位杂交探针疾病名称探针名称浆细胞疾病多发性骨髓,多发性骨髓瘤（,MM,）检测,MM,常涉及多种染色体异常，主要为数目异常，分为超二倍体（,+3,、,+5,、,+7,、,+9,等）和非超二倍体（,-8,、,-13,、,-14,、,-17,等）；染色体结构异常较少见，主要有,1,号（,1p,、,1q,，部分缺失或,1q,三体）、,13q-,、,14q,（多为与,14q32,有关的几种互补易位）等。,MM FISH,检测位点：,P53,、,RB1,、,D13S319,、,IGH,基因及,1q21,位点,。,推荐样本：骨髓,适用人群：,已确诊为,MM,，需评估预后、进行个体化治疗的患者,10,多发性骨髓瘤（MM）检测MM常涉及多种染色体异常，主要为数目,以,p53,探针模式图为例，,17,号染色体,1,区,3,带,1,亚带包含,p53,的区域标记了一段含绿色荧光的,260kb DNA,序列；,D13S319,指,13,号染色体上独一无二的编号,319,的,DNA,片段，标记了一段含红色荧光的,220kb DNA,序列。正常情况下显示,2R2G,信号，发生,D13S319,位点缺失时显示,1R2G,。,IGH,的探针在基因的两端分别标记了红色和绿色荧光，正常情况下显示红色绿色重叠信号或黄色信号，当,IGH,发生易位时显示为红色和绿色的分离荧光信号。,P53/D13S319,探针,（双色探针：,D13S319,红,/P53,绿）,D13S319,P53,正常,异常,IGH,探针（双色分离探针）,14,16,14,16,11,以p53探针模式图为例，17号染色体1区3带1亚带包含p53,临床意义,判断生存期,预后较差：,P53,缺失（,24.7,个月）,1q21,扩增（,21.9,个月）,IGH,发生,t(4;14),，,t(14;16),易位（,24.7,个月）,预后中等（,42.3,个月）：,RB1,缺失,D13S319,缺失,预后较好（,50.5,个月）：,IGH,发生,t(11,；,14),易位或者其他遗传改变,指导临床用药（个体化治疗）,：,MM,的初治治疗多选用化疗，包括,MP,方案（马法兰、泼尼松）、,VAD,方案（长春新碱、多柔比星、地塞米松）等；对于难治和复发的多发性骨髓瘤，多采用联合化疗和沙利度胺进行治疗；干扰素主要用于维持治疗，对上述治疗方法无效者可进行造血干细胞移植。对于预后好的患者，使用,干扰素、环磷酰胺或联合化疗没有明显的区别；对于预后中等的患者，使用,干扰素治疗反而会缩短患者总生存期。可见，多发性骨髓瘤基因异常的检测对临床有效开展个性化治疗提供了重要依据。,12,临床意义判断生存期12,白血病,FISH,检测,1,、,慢性淋巴细胞白血病（,CLL,）检测,检测位点：,P53,、,RB1,、,D13S25,、,ATM,基因以及,12,号染色体,。,推荐样本：,外周血,临床意义：,判断生存期：,预后差，,P53,缺失（,32,个月）,预后较差，,ATM,缺失（,79,个月）,预后中等，,CSP 12,三体（,114,个月）,预后较好，,RB1,缺失、,D13S25,缺失（,133,个月）,指导临床用药（个体化治疗）,7-11%CLL,伴有,P53,缺失，预后不良，漂吟类似物治疗无效，应选用不涉及,p53,信号传导系统的药物；,ATM,位于染色体,11q22-23,，,11q22.3,缺失是,CLL,另外一个预后较差的核型异常，发生率,12-20%,，,ATM,缺失与,CLL,进展密切相关；,+12,是最早发现的,B-CLL,常见染色体异常，发生率,15-35%,，常伴有其他核型异常；,13q,缺失是,CLL,最常见的染色体异常，,40-60%,的,CLL,出现该异常。,RB1,和,D13S25,位于此位点，单纯,del(13q14),预后较好，若伴有,+12,、,11q-,等其他染色体异常，则预后通常较差。,13,白血病FISH检测1、慢性淋巴细胞白血病（CLL）检测,2,、慢性粒细胞白血病（,CML,）检测,检测位点：,BCR/ABL,融合基因、,ASS,基因,。,推荐样本：,骨髓,适用人群：,CML,初诊及治疗监测的患者,慢性粒细胞性白血病是一种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增生性疾病（获得性造血干细胞恶性克隆性疾病）。,对,CML,的检测主要针对,BCR/ABL,融合基因，这种融合基因是通过（,9,；,22,）号染色体的基因重排及易位而形成的。,14,2、慢性粒细胞白血病（CML）检测慢性粒细胞性白血病是,BCR/ABL,融合基因检测,BCR/ABL,融合基因通过,t(9;22),号染色体易位而形成。,9,号染色体上原癌基因,(ABL),的断裂点比较恒定，,22,号上断裂点簇集区,(BCR),的断裂点不恒定。,BCR-ABL-210,见于,95,的,CML(,主要断裂点断裂形成,),，,BCR-ABL-190,见于,17%-30%,的成人急性淋巴细胞白血病和,2%-6%,的儿童急性淋巴细胞白血病,(,次要断裂点断裂形成,),，但从染色体组型与慢性粒细胞白血病的费城染色体在形态上看不出区别，,FISH,检测,BCR/ABL,融合基因可以区分。,检测探针：,额外信号探针（,ES,）：可区分,BCR/ABL,融合基因形成于主要断裂点（,M-BCR,位点）或次要断裂点（,m-BCR,位点）。,双色双融合探针（,DF,）：只可检测是否有,BCR/ABL,融合基因，不能区分主次断裂点。,15,BCR/ABL融合基