第3章高效液相色谱分析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 高效液相色谱分析,高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,一、,HPLC,与经典,LC,区别,二、,HPLC,与,GC,差别,三、高效液相色谱仪流程图,四、特点及应用,一、,HPLC,与经典,LC,区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1,经典,LC,：仅做为一种分离手段,柱内径,13cm,，固定相粒径,100m,且不均匀,常压输送流动相,柱效低（,H,，,n,）,分析周期长,无法在线检测,2,HPLC,：分离和分析,柱内径,26mm,，固定相粒径,10m,（球形,均匀装柱）,高压输送流动相,柱效高（,H,，,n,）,分析时间大大缩短,可以在线检测,二、,HPLC,与,GC,差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测,主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1,分析对象,GC,：,能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，,高沸点、挥发性差、热稳定性差、,离子型及高聚物的样品不可检测,占有机物的,20%,HPLC,：溶解后能制成溶液的样品，,不受样品挥发性和热稳定性的限制,相对分子质量大、难气化、热稳定性差及高分子,和离子型样品均可检测,用途广泛，占有机物的,80%,2,流动相差别,GC,：流动相为惰性气体,组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用,HPLC,：流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、,改善分离度增加了因素，对分离起很大作用,流动相种类较多，选择余地广,流动相极性和,pH,值的选择也对分离起到重要作用,选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相,可以增大分离选择性,3,操作条件差别,GC,：加温操作,HPLC,：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,提高柱内填料装填的均匀性,减小粒度,三、高效液相色谱仪流程图,1,贮液器（滤去颗粒状物质）,2,高压泵,（,1500035000KPa),流量稳定,及梯度洗提装置,3,进样装置,4,色谱柱,分离,5,检测器,分析,6,废液出口或组分收集器,7,记录装置,灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感,高效液相色谱仪的色谱柱,4.6mm,或,3.9mm,球形填料,不规则形填料,510m,空柱管,:200-300,元,国产填料 国产装填,=800-1000,元,进口填料 国产装填,=1200-1500,元,原装 进口柱,=2400-3000,元,HPLC,柱,=,空柱管,+,填料,(,分离介质,),价格,?,高效液相色谱仪的生产厂家,Waters,Agillent,Shimadz,Perkin Elmer,Varian,大连依利特公司,北京东西电子研究所,制造商,高效液相色谱仪,LC-2010HT,岛津（香港）有限公司,新一代液相色谱,Alliance,Alliance,产品名称：液相色谱仪器,大连依利特,返回,四、,HPLC,的特点和应用,“,三高,”,“,一快,”,“,一广,”,高柱效,(n=3,万片,/,米,),柱效高（远高于一般,LC,）,高灵敏度,(,紫外检测器最小检出量达纳克级,),高压,(150*10,5,350*10,5,Pa),分析速度快,应用范围广泛（可分析,80%,有机化合物）,HPLC,应用,医药方面：,生物组织、血样、尿样分析，药剂组,分测定，药物生产控 制，药代研究。,生化方面：,主要用于氨基酸、蛋白质、酶、糠尿。,食品方面：,果汁，饮料，酒类等中的添加剂。,环境方面：,饮用水，废水中质量标准的控制。,大气、土壤污染研究,正常对照组,Fig 2 (control group),诱导后,3,天组,(Hydrocephalus ofthe3day),诱导后,8,天组,(Hydrocephalus of the 8day),诱导后,4,月组,(Hydrocephalus of the 4 month),狗脑积水不同时期脑组织中肌酸、磷酸肌酸及磷酸腺苷酸的含量变化,Cr,Cr,Cr,Crp,Cr,Crp,Crp,AMP,AMP,AMP,AMP,ADP,ADP,Crp,ADP,ATP,ATP,ATP,ATP,ADP,HPLC,法分析心脏衰竭过程中黄连素对心脏能量的保护作用,标准色谱图 心肌样品色谱图,Cr,Crp,AMP,AMP,Cr,Crp,ADP,ADP,ATP,ATP,标准品色谱图 对照组色谱图,FDP,组色谱图,Crp,Crp,Crp,ATP,ATP,ATP,HPLC,法分析人的心脏换瓣术中,1,，,6-,二磷酸果糖,对高能磷酸复合物含量的影响,HPLC,法分析大鼠脑缺血再灌注后肌酸、腺苷和三磷酸腺苷的含量变化,标准色谱图 脑组织样色谱图,ATP,ATP,ADO,ADO,Cr,Cr,HPLC,法分析经缺血预处理后大鼠移植肝脏中三磷酸腺苷的含量变化,肝组织样色谱图 标准色谱图,ATP,AMP,AMP,ATP,ADP,ADP,健康人空白血清色谱图 给药后人血清色谱图,HPLC,法测定健康人血清中的头孢唑啉,(CEZ),CEZ,HPLC,法测定肺癌患者血清中维生素,A,、维生素,E,番茄红素、,-,胡萝卜素,标准色谱图 血清样色谱图,V,A,V,A,V,E,V,E,L,L,HPLC,法测定中草药提取物中紫杉醇的含量,对照品色谱图,样品色谱图,紫杉醇,紫杉醇,1,2,3,4,5,大鼠尿中,83-1,除草剂及其代谢产物的,HPLC,分离图,空白尿样 染毒尿样,*,1,大鼠肝微粒体中叶枯灵及其代射产物分离的,HPLC,色谱图,a,b,a.,对照组,b.,样品组,大鼠肝灌流中叶枯灵、代谢产物及其内标的色谱图,(7),*,*,*,二、,食品、药物的分析,1,3,2,3,1,1,3,5,5,5,4,蕹菜 冬苋菜 对照品,HPLC,法测定,9,种蔬菜中的类胡萝卜素,HPLC,法测定中药辛弗林的含量,标准品色谱图,样品色谱图,辛弗林,辛弗林,HPLC,法测定血清中延胡乙素的血药浓度,样品色谱图,对照品色谱图,延胡乙素,延胡乙素,对照品色谱图,样品色谱图,HPLC,分析银杏叶提取物中懈皮素及总黄酮的含量,懈皮素,懈皮素,山萘酚,异鼠李素,MECC,分离中药黄芩中六种黄酮类成份,P,106,：,解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相,相互作用力,的差别进行分离的。,从仪器构造上看，,液相色谱,需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。,气相色谱的检测器,主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与,MS,等联用。,二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用于,HPLC,分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。,