免疫组化的原理与操作

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组织化学,Immunohistochemistry,概念：免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原抗体反响和组织化学呈色反响来检测组织和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学和组织化学相结合而进展起来的一门新兴学科，也叫原位免疫学In situ immunology。,特点或优点：1特异性强、灵敏度高；,2可定性、定位、定量观看；,3将形态学转变与功能和代谢变化结,合起来；,免疫组化概述,IHC不仅具有传统形态学包括LM和EM水平能对组织和细胞进展认真、客观观看的优点特殊是经苏木精或伊红复染后，而且还抑制了传统免疫学反响只能定性和定量离体、液相，而不能定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进展观看。目前IHC的定位可准确到亚微构造水平。,随着IHC技术的进展和图象分析技术的进展，IHC已进入多标记双标记和定量争论的阶段，使IHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于争论，也用于诊断。IHC与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术in situ hybridization，ISH既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。,IHC技术源于免疫荧光术immunofluorescence,IF，从1941年1950年Coons等用了10年首创了,荧光素标记抗体技术检测肺组织内的肺炎双,球菌，六、七十年月IF在科研中占据着主导地位,1968 年中根一穗Nakane等创立了酶标抗体技,术immunoperoxidase，IPO铁蛋白标记,Ab技术;,1974年Stemberger 改进上述技术，建立辣根过氧,化物酶抗体过氧化物酶PAP技术，使免疫,细胞化学得到广泛应用；,一、IHC的进展简史,80年月Hsu等建立了ABC法之后，免疫金银染色,法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。,90年月 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细,胞化学分类方法快速进展；,2023年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组,化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合,争论的一项有力工具。其应用范围深达医学各个,学科，是目前生命科学工作者应当把握的根本技,术之一；,国内起步晚，从70s开头。,一方法学,1.从传统的抗原、抗体反响免疫反响亲和反响。新的亲和物质对有：生物素与卵白素biotin&avidin)，葡萄球菌A蛋白SPA与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲和对亲和力强，且可与多种标记物荧光素、酶、同位素、胶体金、铁蛋白等结合，由此产生了亲和组织化学affinity histochemistry，这些方法特异性、敏感性、稳定性高，更便利、适于某些特殊观看如EM。,2.从单一显示某种物质单标记显示多种物质双标记。,3.从LMEM超微构造：免疫电镜、胶体金法、金银法。,4.从定性定量，图象分析IA、流式细胞术FCM。,5.IHC与ISH相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。,6.原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。,7.趋于标准化、自动化。,二、IHC的现状和进展前景,二技术分类,1.依据染色方式分成：贴片染色,漂移染色,2.依据Ag-Ab结合方式分成：,直接法,间接法,多层法,3.按标记物的性质分成：,免疫荧光技术免疫荧光法,免疫酶技术酶标抗体法、桥法、PAD法、,ABC法,免疫金属技术免疫铁蛋白法、免疫金染色,法、蛋白A金法,三标记物,1.必要性：组织细胞内Ag-Ab结合反响一般是不行,见的，假设在镜下检测，则必需具有可视性标记物。,2.常用标记物,荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素,Fluorescein isothiocyanate，FITC-荧光显,微镜下呈绿色荧光;四乙基罗达明rhodamine,RB200-荧光显微镜下发橙红色荧光,酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。,生物素：Biotin,铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。,其他：犹如位素因涉及污染和防护难一般不用,四IHC的应用,1.只要是形态科学均可承受:包括病理学、神经科学、生物学、病原微生物的检测病毒、细菌、寄生虫等、皮肤病学、器官移植等。,2.可用于多种材料：A.各种组织冰冻组织、formalin固定组织、石蜡包埋组织兼可；B.各种细胞(穿刺、体液、涂片、血细胞、培育细胞等。,3.用于诊断：肿瘤病理学等大中医院。,4.用于科研：临床和根底医学，尤其是形态学专业争论生常用IHC，或IHC+分生技术；最近几年，分子生物学争论特别活泼，但最终还要归到形态上来，用免疫组织化学方法对所争论的大分子进展定位，进而深入争论其功能。,一标本的收集与处理,IHC染色成功与否及其质量如何，除染色方法本身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、固定、脱水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的数量及活性、保持组织细胞的良好形态构造。材料的来源：人体及试验动物；细胞和组织；新颖的及固定的。,1、组织标本的取材与储存,来源：活检取材、手术切除、试验动物组织等。,要求：要快、要小110.4cm，避开挤压。,处理：冰冻即用或保存；固定即用或保存。,三、样品的预备、处理,2、细胞标本的取材与储存,来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。,处理：细胞多时直接涂片、枯燥、固定、染色；,细胞少需离心沉淀、涂片、枯燥、固定、染色；,对于体外培育细胞：贴壁生长细胞内皮C、纤,维C、神经C等在培育皿底置载玻片；悬浮生长细胞,需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。,二固定fixation,1、固定的含义,固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类变性、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避开Ag溶解、集中、丧失；保持组织细胞的正常形态构造。,依据Ag对固定剂的耐受性，可将其分为：不稳定Ag如细胞外表Ag，不耐甲醛，宜用丙酮、半稳定Ag及稳定Ag，后二者多为蛋白、肽类、酶类物质。,固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联过度，封闭Ag。,2、常用固定剂及其用途,1.10%的formalin4%的甲醛formaldehyde：以pH7.4的PBS配制，优点：穿透力强、固定快、组织收缩小；适于固定蛋白、肽类、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，时间46 h。,2.2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛与2%多聚甲醛混合液固定，尤对超微构造保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭抗原，必要时需抗原修复。,3.70%的酒精乙醇，优点：固定蛋白好，缺点：组织收缩严峻；时间：2h。,4.70%丙酮，优点：渗透快；缺点：对形态保存不好；用于对冰冻切片和细胞涂片的固定；时间：10min。,5.混合固定液：Bouin液：40%PF250ml、冰醋酸50ml、饱和苦味酸250ml；还有PLP固定液，较适合免疫组化。,6.四氧化锇OsO4 锇酸：常用PBS配制1%锇酸溶液后固定1h，用于免疫组化及电镜观看。有猛烈刺激，需在通风橱内操作。,三 组织的脱水、浸蜡、包埋和切片,前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片不需此步骤。,切片可分为：,石蜡切片：脱水、透亮、浸蜡、包埋、切片57m；,冰冻切片：浸糖，20%30%蔗糖4oC过夜，削减冰,晶；OCT包埋；液氮速冻，减轻组织破,坏。病理切片要薄，57 m；脑片通常,3050 m厚。,振动切片：不需做任何包埋，固定后的组织可直接,用振动切片机做各种厚度的切片，并在,染色后可进一步制作电镜标本观看。,四防脱片剂,1 蛋白甘油，蛋清与甘油1：1搅拌、过滤、防腐；,21%的铬矾明胶涂片；,30.1%的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。配制时用塑料,瓶而不能用玻璃瓶；,4 购置商品化的进口硅化玻片；,5APES氨丙基三乙氧基硅烷，1：50丙酮稀释，,浸片2030秒，晾干备用；贴片时要一步到位。,五抗原修复,近年兴起的新技术。目的：暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期formalin固定的标本、石蜡包埋标本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：,1 微波加热 切片煮沸1020min，室温自然冷却，所用溶液有：饱和NaCL溶液；10mMpH 6.0的枸橼酸钠缓冲液；4M的尿素等；pH8.0TBS;,2高压锅处理 将切片放入10mM、pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气310min，自然冷却。,3酶消化处理：常用0.1%的胰蛋白酶含0.1%CaCL2，pH 7.837。C 10min。或0.4%胃蛋白酶37。C 30min;,一根本染色方法,荧光素标记抗体：FITC、,直接法 TRITC等,标记抗体法 酶标记抗体：HRP、AP等,荧光素标记抗体,间接法,酶标记抗体三步法,非标记抗体法：酶桥法、PAP法、APAAP法;,亲和组化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法;,双重标记：阻断法酸洗抗、非阻断法连续染,四、,免疫组织化学技术,1直接法,荧光素直接标记特异性抗体一抗上，标记抗体与抗原结合在切片上荧光显微镜下观看检测抗原。,优点：简洁，时间短，,特异性强。缺点：灵敏度低，所,需抗体量大,不经济。应用：根本不用了！,2间接法 荧光素标记在二抗上二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体。显色后镜检,特点：1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异性较低；,2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；,3、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用PBS代替一抗做空白比照。,3非标记Ab桥法：,“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。,1单桥法,(2)双桥法,在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，,可增大染色强度。,特殊提示：留意动物种属关系,特点：敏感性高，但酶浓度不好把握；与组织非特异性结合的酶不易洗去，背景染色重。,4过氧化物酶抗过氧化物酶法Peroxidase anti-,peroxidase method，简称PAP法,是桥法的改进，用其次抗体作“桥梁”，先与第一抗体结合，,再与PAP复合物联结，形成抗原抗体抗IgG抗体PAP复合物,，最终用底物显色剂显色。,特点：灵敏度高，比间接荧光法敏感20倍，比间接酶标记抗体法敏感100倍,5亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法avidin-biotin-,peroxidase complex technique，简称ABC法。,关键的程序步骤为3步：,Ag+Ab1+Ab2-B+ABC 复合物,Ab2-B 为生物素标记的其次抗体,B 为生物素标记的过氧化物酶,ABC复合物是avidin与酶联biotin 在使用前30min配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。,1ABC复合物的制备：,2ABC法反响原理：,特点：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感2040倍，背景也更清晰。,ABC,法示意图,染色结果观看BrdU,6、酶标亲和素-生物素技术labelled avidin-biotin technique，,简称LAB法。,即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用biotin标记2抗。,关键步骤为3步：,Ag+Ab1+Ab2-B+A,A为HRP标记的卵白素,A与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。,如将该法中的卵白素avidin变换成链霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成LsAB法，或称SP法。,据认为LAB法比ABC法敏感24倍，而LsAB法因链霉卵白素不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。,生物素化,抗,AB,复合物,酶标链卵白素,Avidin,Biotin,Peroxidase,抗,组织抗原,ABC法3步完成,LsABSP法3步完成,链霉卵白素,酶,生物素,底物,抗原,SP,法示意图,二免疫组化染色步骤以ABC法为例1)、切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。2)、灭活内源性酶：博士德推举应用3%的双氧水，但实际操作中，使用30%双氧水和纯甲醇