荧光免疫层析技术的原理与进展课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精选可编辑ppt,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精选可编辑ppt,*,荧光免疫层析技术的原理与进展,介绍人：罗敏,1,精选可编辑ppt,荧光免疫层析技术的原理与进展介绍人：罗敏1精选可编辑ppt,荧光免疫层析技术的基本原理,层析法,(chromatography),的原理是利用混合物中各组分的物理性质之差,(,如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等,),而建立来的一种分离技术。,层析系统是由固定相,(stationary phase),和流动,(Mobile Phase),相组成。,2,精选可编辑ppt,荧光免疫层析技术的基本原理2精选可编辑ppt,固定相是固体物质或固定于固体物质上的成分。,流动相是可以流动的物质，如水或各种溶剂。,层析过程：当待分离混合物随流动相通过固定相时，由于混合物各组分的理化性质的差异，与固定相相互作用弱的组分随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的速度快；与固定相相互作用强的组分向前移动的速度慢。从而实现混合物中各组分的分离。,3,精选可编辑ppt,固定相是固体物质或固定于固体物质上的成分。3精选可编辑ppt,免疫层析法,免疫层析技术是建立在层析技术和抗原一抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。,4,精选可编辑ppt,免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。,待测物在,T,线处发生特异性免疫反应。,游离物在,C,线处发生免疫反应。,待测物,层析方向,免疫反应,T,C,免疫层析技术基本原理示意图,5,精选可编辑ppt,免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相,荧光,（,fluorescence,）,荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。,发射光谱和激发光谱,发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。,激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。,6,精选可编辑ppt,荧光（fluorescence）荧光物质吸收激发光的能量,荧光效率,定义,:,荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率,计算公式,:,荧光效率,=,荧光寿命,定义,:,荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。,各种荧光物质的荧光寿命不同。,7,精选可编辑ppt,荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率荧光寿命定,荧光淬灭,定义,:,荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。,引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。,8,精选可编辑ppt,荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至,免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。,待测物在,T,线处发生特异性免疫反应。,游离物在,C,线处发生免疫反应。,待测物,层析方向,免疫反应,T,C,免疫层析技术基本原理示意图,9,精选可编辑ppt,免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相,常用荧光,免疫层析法,夹心法,竞争法,双抗原夹心法,双抗体夹心法,10,精选可编辑ppt,常用荧光免疫层析法夹心法竞争法双抗原夹心法双抗体夹心法10精,竞争法,待测物中的某种抗原与,T,（检测线）线处同种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。,11,精选可编辑ppt,竞争法11精选可编辑ppt,竞争法,含抗原A,Y1:A的单抗与标记物的偶联体,Y2：抗原A,Y3:羊抗鼠二抗,结合垫,免疫层析法检测的实物图,12,精选可编辑ppt,竞争法含抗原AY1:A的单抗与标记物的,夹心法,待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A（抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗原+抗体B形式的夹心结构。,结合垫,免疫层析法检测的实物图,13,精选可编辑ppt,夹心法待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A（抗原A）以及荧,双抗体夹心法,(k)Ab1-Ag-Ab2,(k)Ab1,(k)Ab1-Ag,Ab2,Ab3-(k)Ab1,T,C,阳性结果,T,C,均有颜色,待测液含抗原,Ag,待测液，不含抗原,Ag,(k)Ab1,(k)Ab1,(k)Ab1,Ab2,T,C,Ab3-(k)Ab1,阴性结果,T,无颜色，,C,有颜色,双抗体加心法检测原理图,K,代表某一标记物,结合垫,免疫层析法检测的实物图,14,精选可编辑ppt,双抗体夹心法(k)Ab1-Ag-Ab2(k)Ab1(k)Ab,双抗原夹心法,双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）,15,精选可编辑ppt,双抗原夹心法双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）,利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测物的定性或者定量检测,.,16,精选可编辑ppt,利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测物的定性或者定量检测.1,其他,碳纳米管,纳米磁性材料,有机纳米粒子,镧系元素,量子点,胶体金,标记物,17,精选可编辑ppt,其他碳纳米管纳米磁性材料有机纳米粒子镧系元素量子点胶体金标记,金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相对稳定的状态，形成稳定的水溶性胶体，即称为胶体金,胶体金,18,精选可编辑ppt,金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相对稳定的状态，形成稳,胶体金既有明亮的色彩，又有高电子密度，可以吸附生物大分子，且不影响生物分子的活性，故可作为生物分子的标志物，用于免疫反应中抗原或抗体的标记定位，定性甚至定量研究。层析试纸标记用金颗粒的直径大多在,20,40 nm,，呈深红色。,19,精选可编辑ppt,胶体金既有明亮的色彩，又有高电子密度，可以吸附生物大分子，且,胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗粒表面的过程。,由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。,20,精选可编辑ppt,胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗粒表面的过程。20,胶体金作为标志物有以下优势,:,几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单，效率高，用量少，便宜，基本不改变被标记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便，保质期长。,不同直径的纳米金可以用于多重标记。,结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼观察。,21,精选可编辑ppt,胶体金作为标志物有以下优势:21精选可编辑ppt,胶体金作为标记物的应用,22,精选可编辑ppt,胶体金作为标记物的应用22精选可编辑ppt,试孕纸,23,精选可编辑ppt,试孕纸23精选可编辑ppt,24,精选可编辑ppt,24精选可编辑ppt,应用（,定量,）,08,天津大学精密仪器与光电子工程学院与天津市进出口检验检疫局合作开发研发一种便携式仪器。,竞争法原理,用于农药残留定量检测,25,精选可编辑ppt,应用（定量）08天津大学精密仪器与光电子工程学院与天津市,2,镧系元素,镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周期表中原子序数,57,71,的所有元素。,26,精选可编辑ppt,2 镧系元素镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周期表中原子序,两种不同镧系元素离子,(,分别作为光吸收子和发射子,),掺杂入亚微米尺寸的陶瓷颗粒,(,作为主基质,),中，会构成一类能上转发光产生荧光的特殊材料。,UCP(up-converting phosphor,，,UCP),颗粒。,27,精选可编辑ppt,两种不同镧系元素离子(分别作为光吸收子和发射子)掺杂入亚,UCP,颗粒主要含有如下三种成分,:,主基质：氧硫化物（,Y,2,O,2,S,GdO,2,S,）、氟化物,(YF,3,GdF,3,）、硅酸盐,(YSi,2,O,5,YSi,3,O,7,）,.,吸收子,Yb,3+,Er,3+,Sm,3+,发射子,Er,3+,Ho,3+,Tm,3+,A2,S1,S2,A1,A3,28,精选可编辑ppt,UCP 颗粒主要含有如下三种成分:A2S1S2A1A328,UCP,独特的优势,高敏感性，有报道,UCP,的灵敏度可达胶体金的,100,倍。,高稳定性，,UCP,的发光信号不受检测环境或样品腐蚀或标志物自身衰变等的影响，可长期存放和可重复。,使用简便，安全无毒，可适用于定量分析与多重分析，在一般的实验室或野外现场都可轻松应用,.,29,精选可编辑ppt,UCP独特的优势高敏感性，有报道 UCP 的灵敏度可达胶体,中科院报道了一种用于免疫活性检测的,UCP,试纸条读数计，采用半导体激光器作为光源，,CCD,作为光电接收器，步进电机带动控制试纸条移动的装置,UCP应用举例,30,精选可编辑ppt,中科院报道了一种用于免疫活性检测的UCP试纸条读数计，采用半,军事医学科学院研制出一种,UPT,十通道免疫层析试纸盘，同时检测多种抗体以确证是否感染鼠疫菌,31,精选可编辑ppt,军事医学科学院研制出一种UPT十通道免疫层析试纸盘，同时检测,霍乱弧菌,霍乱,烈性肠道传染病,甲胎蛋白,(AFP,）,-,肝癌的特异性指标。,32,精选可编辑ppt,32精选可编辑ppt,3,量子点,量子点,(quantum dots,，,QDs),，主要指主族,(,如,CdSe),，,(,如,InP,、,InAs,、,GaSe),，副族化合物以及,Si,等元素组成的纳米颗粒,33,精选可编辑ppt,3 量子点33精选可编辑ppt,QDs,有可精确调谐的发射波长，通过调整粒子尺寸可得到不同发射光谱，即可使用大小不同的同种,QDs,颗粒实现不同颜色标记。,34,精选可编辑ppt,QDs 有可精确调谐的发射波长，通过调整粒子尺寸可得到不同,较大的,Stokes,位移和狭窄对称的荧光谱峰。,使得用同一激发光源可同时激发不同大小的量子点，产生不同发射光谱，使同步检测多样本成为可能。,QDs,荧光性质稳定，可长期保存，经受反复多次激发。,35,精选可编辑ppt,较大的Stokes 位移和狭窄对称的荧光谱峰。35精选可编,生物相容性好,物理结合,化学偶联,36,精选可编辑ppt,36精选可编辑ppt,量子点是一种新的荧光标记物，目前在免疫层析中得应用相对,UCP,，胶体金较少见报道。,张国华，赖卫华等，量子点标记免疫层析试纸条快速检测莱克多巴胺的研究,J,，,2009,，以,CdSe,为标记物，对莱克多巴胺,(,一种苯酚胺类,-,肾上腺素激动剂,),快速定量检测。,胡华军，付 涛等，,CdTe/ZnSe,核壳量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗的研究，,2010,检测克伦特罗,(Clenbuterol,，,CLE),属于,-,兴奋剂类药物,又称“瘦肉精”,量子点在免疫层析中的应用,37,精选可编辑ppt,量子点是一种新的荧光标记物，目前在免疫层析中得应用相对UCP,4,有机纳米粒子,荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期常用于免疫层析技术中的一大类标志物，如异硫,氰酸酯荧光素，标记原理基本都是利用荧光分子中的异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中的氨基结合，实现对蛋白的标记，同时以分子中的荧光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米粒子的荧光发射依赖于粒子本身的化学发光集团不具有无机纳米粒子的波长可调控的尺寸效应。,38,精选可编辑ppt,4有机纳米粒子荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期常用,5,纳米磁性颗粒,纳米磁性颗粒,(magnetic nanoparticle,，,MNs),也被称为超顺磁颗粒，它结合了磁性粒子和纳米材料的优点，具有粒径小、超顺磁性和比表面积大等特性。,39,精选可编辑ppt,5纳米磁性颗粒39精选可编辑ppt,典型的是以磁性材料四氧化三铁,.,表面引入活性基团，通过耦联反应与酶、抗体等生物分子结合形成生物标志物,.,超顺磁性,.,40,精选可编辑ppt,典型的是以磁