高效液相色谱法课件

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,概述,基本原理,各类高效液相色谱法,固定相,流动相,高效液相色谱仪,返回章目录,小结,习题解答,高效液相色谱法虚拟实验软件,返回章目录,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,概述,基本原理,各类高效液相色谱法,固定相,流动相,高效液相色谱仪,返回章目录,小结,习题解答,高效液相色谱法虚拟实验软件,高效液相色谱法,High Performance Liquid Chromatography,分析化学教研室,高效液相色谱仪分析流程仿真系统,高效液相色谱法 High Performance Liqu,1,高效液相色谱法,概述,1,基本原理,2,各类高效液相色谱法,3,固定相,4,流动相,5,高效液相色谱仪,6,小结,习题及解答,高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流,2,一、概 述,高效液相色谱法,：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。,简称：,HPLC,；,HRLC,；,SPLC,；,UPLC,超高效液相色谱（,Ultra Performance Liquid Chromatography,）,与经典,LC,相比,高效,高效填料：,3,5m,高压泵输液,高灵敏度的检测器,:,在线检测,一、概 述高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的,3,一、概 述,分析对象,流动相差别,GC,能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的,20%,惰性气体,HPLC,不受样品挥发性和热稳定性的限制，占有机物的,80%,液体，种类较多，选择余地广,HPLC,与,GC,区别,一、概 述分析对象流动相差别GCHPLCHPLC与GC区别,4,一、概 述,HPLC,仪器示意图,一、概 述HPLC仪器示意图,5,一、概 述,Agilent 1100,一、概 述Agilent 1100,6,一、概 述,HPLC,仪器图,SHIMADZU,AGILENT,WATERS,一、概 述HPLC仪器图SHIMADZUAGILENTWAT,7,一、概 述,application,一、概 述application,8,高效液相色谱法,概述,1,基本原理,2,各类高效液相色谱法,3,固定相,4,流动相,5,高效液相色谱仪,6,高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流,9,二、基本原理,范氏方程,（,Van Deemter equation,),：重要,GC,：,填充柱,H=A+B,/,u+Cu,开口毛细管柱,H=B,/,u+Cu,HPLC,：,H=A+Cu,原因：,T,；,；,u,忽略,B,/,u,二、基本原理范氏方程（Van Deemter equatio,10,二、基本原理,GC,和,HPLC,的,H-u,图,(1),B/u,(2),Cu,(3),A,(4),HPLC,的,u,opt,(5),GC,的,u,opt,二、基本原理GC 和 HPLC 的 H-u 图,11,二、基本原理,HPLC,：,H=A+Cu,A=2d,p,C=C,m,+C,sm,影响因素,：,选球形固定相，高压、匀浆装柱法,d,p,选粒径小的化学键合相,C,选粘度小、低流速的流动相,范氏方程,（,van Deemter equation),二、基本原理HPLC：H=A+Cu范氏方,12,高效液相色谱法,概述,1,基本原理,2,各类高效液相色谱法,3,固定相,4,流动相,5,高效液相色谱仪,6,高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流,13,三、各类高效液相色谱法,液固吸附色谱法（,LSC,）,1,液液分配色谱法（,LLC,）,2,化学键合相色谱法（,BPC,）,3,三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法（LSC）1液液分配色,14,三、各类高效液相色谱法,液固吸附色谱法,分离机理,:,组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活性中心,固定相,:,硅胶,流动相,:,底剂（烷烃）,+,极性调节剂,出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱,例如：,TLC,三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法,15,三、各类高效液相色谱法,液液分配色谱法,分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异,分类,:,概念及保留行为（重要）,正相色谱,NPLC,固定液极性,流动相极性,极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱,反相色谱,RPLC,固定液极性,流动相极性,极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱,三、各类高效液相色谱法液液分配色谱法 正相色谱 固定液极性,16,三、各类高效液相色谱法,化学键合相色谱法,(bonded phase chromatography,，,BPC),概念：固定液的官能团通过,化学反应键合在载体表面,反相键合相,离子抑制,正相键合相,离子对,三、各类高效液相色谱法化学键合相色谱法概念：固定液的官能团通,17,三、各类高效液相色谱法,反相键合相色谱法,(RBPC),分离机制,：疏溶剂理论等,固定相：非极性的键合相,如,:,十八烷基硅烷键合相（,ODS,；,C,18,柱,),流动相：极性大的流动相,如,:,甲醇,-,水或乙腈,-,水,流动相极性与,k,的关系,:,极性，洗脱能力，,k,，组分,t,R,极性大的组分先出柱,应用：非极性,-,中等极性组分,(80%),三、各类高效液相色谱法反相键合相色谱法(RBPC),18,三、各类高效液相色谱法,2.,正相键合相色谱法,(NBPC),分离机制,：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力的差别,固定相：极性大的氰基或氨基键合相,流动相：极性小的底剂（烷烃）,+,极性调节剂,流动相极性与,k,的关系,：,流动相极性，洗脱能力，组分,t,R,，,k,结构相近组分，极性大的组分后出柱,三、各类高效液相色谱法2.正相键合相色谱法(NBPC),19,三、各类高效液相色谱法,3.,离子对色谱法,(IPC,PIC),分离机制,：在流动相中加入离子对试剂，使形成不带电的中性离子对，以改善分离,机理：,流动相 固定相,B+H,+,BH,+,+,RSO,3,Na,RSO,-,3,+Na,+,BH,+,.,RSO,-,3,BH,+,.,RSO,-,3,中性离子对,增加了在非极性固定相中溶解度。,三、各类高效液相色谱法3.离子对色谱法(IPC,PIC),20,三、各类高效液相色谱法,常用离子对试剂：,分析对象,离子对试剂,例如,碱,烷基磺酸钠,C,5,、,C,6,、,C,7,、,C,8,磺酸钠,SDS,酸,四丁基季铵盐,四丁基胺磷酸盐（,TBA,）,三、各类高效液相色谱法常用离子对试剂：分析对象离子对试剂例,21,三、各类高效液相色谱法,4.,离子抑制色谱法,(ISC),分离机制,：通过调节流动相的,pH,，抑制组分离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，弱碱的目的,适用范围：,3.0pK,a,7.0,的弱酸,7.0pK,a,8.0,的弱碱,抑制剂,:,弱酸（,HAc,）、弱碱（,NH,3,H,2,O,）或缓冲液,三、各类高效液相色谱法4.离子抑制色谱法(ISC),22,HPLC,概述,1,基本原理,2,各类高效液相色谱法,3,固定相,4,流动相,5,高效液相色谱仪,6,HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5,23,四、固定相,液,-,固色谱固定相,载体：,硅胶,无定形全多孔硅胶,YWG,球形全多孔硅胶,YQG,高分子多孔微球,YSG,特点：柱选择性好，峰形好，柱效低,四、固定相液-固色谱固定相,24,四、固定相,化学键合相,特点,：,不易流失,；,热稳定性好；化学性能稳定,载样量大；适于梯度洗脱,分类,：,非极性键合相：,ODS,中等极性键合相：醚基键合相,极性键合相：氨基、氯基键合相,四、固定相化学键合相非极性键合相：ODS中等极性键合相：醚基,25,四、固定相,非极性键合相：,ODS,载体：全多孔,YWG,，,YQG,、堆积硅球,表面覆盖度：,参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。,其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。,键合基团键长：键长,，载样量,，,k,四、固定相非极性键合相：ODS,26,HPLC,概述,1,基本原理,2,各类高效液相色谱法,3,固定相,4,流动相,5,高效液相色谱仪,6,HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5,27,五、流动相,要求：,与固定液不反应；对样品有良好溶解度,粘度小；与检测器匹配,与固定相性质和流动相种类有关,k,与流动相配比有关,五、流动相要求：,28,五、流动相,正相洗脱流动相的极性小于固定相的洗脱,反相洗脱流动相的极性大于固定相的洗脱,洗脱方式：,等度洗脱,(,isocratic elution,),恒定配比的溶剂系统洗脱,梯度洗脱,(,gradient elution,),在一个分析周期内不断改变流动相的比例,五、流动相正相洗脱流动相的极性小于固定相的洗脱等度洗脱(,29,五、流动相,五、流动相,30,HPLC,概述,1,基本原理,2,各类高效液相色谱法,3,固定相,4,流动相,5,高效液相色谱仪,6,HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5,31,六、高效液相色谱仪,输液泵,进样器,色谱柱,检测器,工作站,高效液相色谱仪,HPLC,六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站高效液相色谱,32,六、高效液相色谱仪,输液泵,进样器色谱柱检测器工作站,泵：恒压泵,恒流泵,:,柱塞往复泵,六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站,33,六、高效液相色谱仪,Agilent,二元泵示意图,六、高效液相色谱仪Agilent 二元泵示意图,34,六、高效液相色谱仪,输液泵,进样器,色谱柱检测器工作站,六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站,35,六、高效液相色谱仪,输液泵进样器,色谱柱,检测器工作站,色谱柱：由柱管,(,不锈钢管,),和固定相组成,分析柱,2-4.6mm L 10-25cm,常量柱,1-1.5mm L 10-20cm,常微量柱,制备柱,20-50mm L 3-25cm,六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站,36,六、高效液相色谱仪,输液泵进样器色谱柱,检测器,工作站,检测器,:,紫外检测器,荧光检测器,蒸发光散射检测器,其它检测器,六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站,37,六、高效液相色谱仪,输液泵进样器色谱柱,检测器,工作站,六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站,38,六、高效液相色谱仪,T/min,波长,(nm),色谱光谱图,六、高效液相色谱仪T/min波长(nm)色谱光谱图,39,六、高效液相色谱仪,输液泵进样器色谱柱,检测器,工作站,2489UVD,2414RID,2424ELSD,2465ECD,WATERS,WATERS,六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站24,40,六、高效液相色谱仪,超高效液相色谱仪,(waters),六、高效液相色谱仪超高效液相色谱仪(waters),41,小结,熟悉,掌握,了解,HPLC,的特点,.,HPLC,的仪器结构及各部件,.,HPLC,中色谱条件的选择,.,化学键合相色谱法,.,范氏方程在,HPLC,的表达形式,.,分离度影响因素,正相色谱和,反相色谱,.,小结熟悉掌握了解HPLC的特点.HPLC中色谱条件的选择.范,42,习题及解答,3.HPLC,流动相的,pH,值应控制为,_,小于,H=A+Cu,2-8,