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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,荧光素酶报告基因系统,课程内容,实验原理,实验仪器设备,实验试剂及耗材,操作步骤,应用举例,重点内容,Luciferase,报告基因系统,以荧光素,(luciferin),为底物来检测萤火虫荧光素酶,(firefly,luciferase),活性的一种报告系统。,荧光素酶可以催化,luciferin,氧化成,oxyluciferin,，在,luciferin,氧化的过程中，会发出生物荧光,(bioluminescence),。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪,(luminometer),或液闪测定仪测定,luciferin,氧化过程中释放的生物荧光。,荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。,双荧光素酶报告基因测试,结合萤火虫和海肾荧光素酶的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。,体外分泌的荧光素基因,:,目前,NEB,公司提供新型的可在细胞外分泌的荧光素酶,分别是,Gluc,和,Cluc,具体使用帮助可在,NEB,官方网站找到,.,转录因子活性检测实验原理,（,1,）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如,pGL3-basic,等,（,2,）将要检测的转录因子表达质粒，与报告基因质粒和对照质粒共转染。如果此转录因子能够激活靶启动子则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度呈正比。,（,3,）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。,生物信息分析,序列插入和质粒构建,质粒转染和细胞培养,miRNA,活性检测实验原理,（,1,）构建一个将靶,3-UTR,的特定片段插入到荧光素酶表达序列后方的报告基因质粒，如,pGL3-basic,等,（,2,）将要检测的,miRNA,，与报告基因质粒和对照质粒共转染。如果此,miRNA,能够抑制靶,3-UTR,则荧光素酶基因表达降低，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度呈反比。,（,3,）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断,miRNA,是否能与此靶,3-UTR,片段有作用。,生物信息分析,序列插入和质粒构建,质粒转染和细胞培养,实验试剂及耗材,双荧光素酶报告基因试剂盒：,实验试剂及耗材,转染试剂,HEK293,细胞（人肾上皮细胞系）,实验仪器设备,转录因子活性检测实验步骤,（,1,）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。,（,2,）设计引物用,PCR,法从基因组,DNA,中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入荧光素酶报告基因质粒,pGL3-basic,（,3,）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用,。,（,4,）扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用,（,5,）培养目的细胞，并接种于,24,孔板中，生长,10-24,小时（,80%,汇合度）。,（,6,）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞,（,7,）提取蛋白并用于荧光素酶检测。,（,8,）加入底物，测定荧光素酶的活性。,（,9,）计算相对荧光强度，并与空载对照比较。,http:/www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/,3UTR,序列查询,3UTR,序列查询,3,-UTR,生物信息分析,序列插入和质粒构建,质粒转染和细胞培养,仪器使用,应用举例,应用举例,活体动物成像,原理：以荧光素酶标记细胞或动物模型,应用,优点和缺点,本次课程重点内容,应用荧光素酶报告基因系统检测转录因子活性实验原理,应用荧光素酶报告基因系统检测,miRNA,活性实验原理,转录因子活性检测实验原理,（,1,）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如,pGL3-basic,等,（,2,）将要检测的转录因子表达质粒，与报告基因质粒和对照质粒共转染。如果此转录因子能够激活靶启动子则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度呈正比。,（,3,）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。,miRNA,活性检测实验原理,（,1,）构建一个将靶,3-UTR,的特定片段插入到荧光素酶表达序列后方的报告基因质粒，如,pGL3-basic,等,（,2,）将要检测的,miRNA,，与报告基因质粒和对照质粒共转染。如果此,miRNA,能够抑制靶,3-UTR,则荧光素酶基因表达降低，荧光素酶的表达量与,miRNA,的作用强度呈反比。,（,3,）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断,miRNA,是否能与此靶,3-UTR,片段有作用。,
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