--分子标记及基因芯片技术及应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子标记及基因芯片技术及应用,第十二章,第一节 分子标记技术和应用,分子标记的概念,分子标记类型,标记系统在应用时的选择,分子标记的应用,一、分子标记的概念,广义的分子标记,（,molecular marker,）：可遗传的并可检测的,DNA,序列或蛋白。包括蛋白质标记和,DNA,标记（狭义的分子标记）。,蛋白质标记包括动植物蛋白、同工酶及等位酶。,理想的分子标记：,1.,高多态性,2.,共显性遗传,3.,能明确辨别等位基因,4.,遍布整个基因组,5.,无基因多效性,6.,检测手段简单快速,7.,成本低廉,8.,重复性好,二、分子标记的类型,以分子杂交为核心的分子标记：,限制性片段长度多态性（,restriction fragment length polymorphism,，,RFLP,）,可变数目串联重复位点（,variable number tandem repeat,，,VNTR,）,二、分子标记的类型,以,PCR,为基础的分子标记：,随机扩增多态,DNA,（,random amplified polymorphic DNA,，,RAPD,）,扩增片段长度多态性（,amplified fragment length poly-,morphism,，,AFLP,）,简单重复序列多态性（,simple sequence repeat,，,SSR,）,单链构型多态性（,single strand conformation polymorphism,，,SSCP,）,二、分子标记的类型,以,DNA,序列为核心的分子标记：,转录间隔区（,internal transcribed spacer,，,ITS,）测序分析技术,单核苷酸多态性（,single nucleotide polymorphism,，,SNP,）,1.RFLP,标记,（,1,）,RFLP,原理,RFLP,：,限制性片段长度多态性（restriction,fragment length polymorphism）,RFLP,指应用特定的核酸内切酶切割有关的,DNA,分子所产生的,DNA,片段在长度上的变化。,细胞内,DNA,量通常用绝对量（,Pg,）或碱基对（,bp,）数目表示，也常用千碱基对（,Kb,）或万碱基对（,Mb,）表示。,1Pg=0.965109bp=6.11011dalton=29cM,（,1,）,RFLP,原理,生物能快速、精确地复制自身的,DNA,，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的,DNA,序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不可能有两个生物体,DNA,的碱基序列是相同的。,限制性内切酶酶解,DNA,长链，是识别,DNA,上的特异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基对越少，,DNA,分子中被识别的位点越多，所产生的限制片段越短。,（,1,）,RFLP,原理,来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源,DNA,分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，,DNA,会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。,（,1,）,RFLP,原理,用限制性酶来酶解植物核,DNA,会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。,进行,Southern,印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的,DNA,杂交，经过放射自显影就能检测到高等植物核,DNA,的,RFLP,。,0.1kb,0.2kb,0.4kb,0.5kb,0.3kb,0.4kb,0.5kb,(1),(2),0.2kb,0.3kb,0.5kb,品系,1,品系,2,0.4kb,0.1kb,+,（,2,）,RFLP,的方法与步骤,（,1,）,DNA,的分离：可用,CTAB,法或,SDS,法,（,2,）酶切：一般根据基因组总,DNA,的复杂性选用限制酶。,（,3,）琼脂糖凝胶电泳,（,4,）,Southern,印迹转移,（,5,）,DNA,杂交及放射自显影,（,3,）,RFLP,的优缺点,优点,（,1,）不受性别、年龄局限，不会受表达的组织、发育阶段或外界环境的不同而受影,（,2,）标记座位的等位基因间是共显性的，通过杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性纯合子,（,3,）,RFLP,标记源于基因组,DNA,自身变异，在数量上几乎不受限制。,（,3,）,RFLP,的优缺点,缺点,（,1,）,DNA,需要量大。,510,g,（,2,）所需一起较多,（,3,）技术较为复杂,（,4,）大多数,RFLP,表现为二态性，杂合率低于,50%,，所提供的信息量较低,（,5,）与内切酶选用密切相关,2.RAPD,标记,随机扩增多态,DNA,（,random amplified polymorphic DNA,，,RAPD,）,1990,年，由美国杜邦公司的科学家,Williams,推出。,RAPD,方法是在,PCR,技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为,10,个核苷酸），对所研究的基因组,DNA,进行,PCR,扩增，引物与基因组,DNA,某一区段互补时，就与其结合，就可对引物下游,DNA,进行合成，即扩增。,（,1,）,RAPD,的基本概念和原理,RAPD,的引物：,（,1,）为随机引物,（,2,）序列较短（通常为,10,个核苷酸）,（,3,）为一个寡核苷酸单链引物,0.2kb,0.5kb,0.3kb,0.2kb,0.5kb,0.3kb,0.2kb,0.3kb,0.5kb,品系,1,品系,2,（,2,）,RAPD,的基本实验程序,1.DNA,的提取,（,1,）碱法 （,2,）,CTAB,法 （,3,）,SDS,法,2.,模板,DNA,浓度和质量的检测,3.PCR,扩增,4.,电泳检测：,PCR,结束后每个样品加,4ul,凝胶上样缓冲液，每个泳道点样,20ul,。,5.,将凝胶浸于,1ug/ml,的,EB,中,30min60min,，用水清洗约,10min,，观察、拍照。,6.,统计分析：记录条带清晰的,RAPD,条带，计算带纹相似率；计算带频率、群内遗传纯度；计算,DNA,片段大小。,（,3,）,RAPD,结果,（,4,）,RAPD,的优缺点,优点：,（,1,）不需,DNA,探针，设计引物不需知道序列信息。覆盖整个基因组。具有广泛适用性和通用性。,（,2,）用一个引物可扩增出多片段。,（,3,）技术简单，需要样品量少，成本低。,（,4,）每个,RAPD,标记相当于基因组分析中的靶序列位点，简化信息的转移过程。,（,5,）可以对,RFLP,难以分析的基因组区域做出遗传连锁图。,（,6,）分析自动化。,（,7,）标记显性遗传，不鉴别杂合子和纯合子。,（,4,）,RAPD,的优缺点,缺点：,（,1,）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。,（,2,）对反应条件敏感，重复性差。包括模板浓度、,Mg,2+,浓度，,PCR,反应中条件的变化等。,（,3,）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段不一定同源；一条带可能包含不同的产物。,3.AFLP,标记,AFLP,：扩增片段长度多态性（,amplified fragment length polymorphism,）,AFLP,技术是,1992,年由荷兰,Keygene,公司的科学家,Zabeau,Mare,和,Vos,Pieter,发明并发展起来的一种选择扩增限制酶切片段的方法。,（,1,）,AFLP,的基本原理,植物基因组,DNA,经限制性内切酶消化形成相对分子量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定的接头连接在这些,DNA,片段两端，接头序列和邻近限制性酶切位点作为引物进行,PCR,扩增，最后通过,PAGE,分离扩增的特异限制性片段。在不需要,DNA,序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单个反应中检测到大量的片段。,AFLP,引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为,18,20,个核苷酸。引物主要由,3,部分组成：,（,1,）核心序列（,CORE,），该序列与人工接头互补；,（,2,）限制性内切酶识别特异序列（,ENZ,）；,（,3,）选择性延伸序列（,EXT,），即引物,3,端的选择碱基，选择碱基延伸到,酶切片段区,。,如：,EcoRI,引物和,MseI,引物,CORE,ENZ,EXT,EcoRI,5 -GACTGCGTACC AATTC NNN-3,MseI,5 -GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3,（,1,）,AFLP,的基本原理,（,2,）,AFLP,的优缺点,优点：,（,1,）少量引物可获得较多标记，,50150,条带,（,2,）多为显性标记或共显性标记，受环境影响小，无复等位效应,（,3,）带型清晰，具高分别率,（,4,）由于用两种引物经两步选择扩增，带型稳定，带纹丰富，灵敏度高，重复性好,（,5,）不需事先知道,DNA,序列信息,缺点：操作复杂，费用较高,4.SSR,标记,SSR,：简单重复序列（,simple sequence repeat,）多态性，也叫微卫星标记。,微卫星：即短串联重复,(Short Tandem Repeat,，,STR),，它是由,2-6bp,重复单位构成的,DNA,序列，通常多态性片段长度在,100-300bp,。以人类基因组为例，平均每,15-20kb,就存在,1,个,STR,座位，据此估计整个人类基因组中大约有,50,000-100,000,个,STR,位点。由于微卫星,DNA,具有高度的多态性和遗传稳定性，所以非常适合作为遗传学,DNA,分子标记，,4.SSR,标记,真核生物基因组中散布着大量的小微卫星,DNA,，微卫星,DNA,由更短的重复单位串联而成，重复长度一般为,26bp,，一个,SSR,总长度可达几十到几百,bp,。许多微卫星间的不等交换或复制过程中的,DNA,滑动而高度可变，因而显示出了丰富的限制性片段多态性。正因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列两端往往是相对保守的限制酶位点，所以通过特异引物进行,PCR,扩增反应、琼脂糖凝胶电泳和放射自显影，就可检测到简单重复序列单位数不同的,DNA,区域多态性。,三、标记系统在应用时的选择,RFLP,RAPD,AFLP,SSR,SNP,遗传特性,共显性,显性,显性,/,共显性,显性,显性,/,共显性,多态性,低,中等,高,高,低,检测基础,分子杂交,随机,RCP,专一,PCR,专一,PCR,专一,PCR,检测基因组部位,单,/,低拷贝,整个基因组,整个基因组,重复序列区,整个基因组,技术难度,难,易,易,易,易,DNA,质量,高,低,低,低,低,DNA,用量,510,g,50ng,50ng,50ng,50ng,使用同位素,是,否,是,/,否,否,否,探针,DNA,短片段,随即引物,专一引物,专一引物,专一引物,费用,中等,低,高,高,高,四、分子标记的应用,分子标记遗传图谱的构建和基因定位,分子标记对质量性状的基因定位,数量性状基因位点（,QTL,）分子标记对定位的研究,分子标记辅助选择育种,比较基因组分析,分子标记用于种质鉴定的研究,第二节 基因芯片技术和应用,概念：采用原位合成或直接点样的方法将,大量,DNA,片段或寡核苷酸片段,以预先设计的方式排列在,硅片、玻璃等介质,上形成微矩阵，待检测样品用荧光分子标记后，于微矩阵杂交，通过,荧光扫描及计算机分析,即可获得样品中大量的基因序列及表达信息，以达到快速、高效、高通量的分析生物信息的目的。,第二节 基因芯片技术和应用,类型,按载体材料分：玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片,按点样方式分：原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片,按,DNA,种类分：寡核苷酸芯片、,cDNA,芯片,按用途分：表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片和毒理芯片,三维芯片,PNA,芯片,第二节 基因芯片技术和