新版抗体制备技术

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,新版抗体制备技术,新版抗体制备技术,第1页,Ab1,Ab3,Ab4,单克隆抗体,抗原,Ab1,抗血清,Ab1,Ab2,Ab3,Ab4,Ab2,Ab3,Ab4,普通抗血清（多克隆抗体）,脾,B,细胞,骨髓瘤小鼠取腹水,骨髓瘤细胞,HAT,培养，稀释,单克隆抗体和多克隆抗体产生区分示意图,杂交瘤细胞,+PEG,融合,Ab2,新版抗体制备技术,第2页,抗体制备技术,一、多克隆抗体制备,（一）免疫原制备,（二）免疫动物,（三）免疫血清纯化,（四）免疫血清判定,（五）免疫血清,二、单克隆抗体制备,（一）单克隆抗体制备原理,新版抗体制备技术,第3页,抗体制备技术,（二）单克隆抗体制备技术关键点,（三）影响杂交瘤技术原因,（四）单克隆抗体应用,三、基因工程抗体技术,（一）人源化抗体,（二）小分子抗体,（三）双特异性抗体,（四）抗体库技术,新版抗体制备技术,第4页,一、多克隆抗体制备,（一）免疫原制备,免疫原（,immunogen,）指能刺激机体免疫系,统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞抗原最,主要性质是免疫原性（,immunogenicity,）,免疫原,天然抗原、人工或合成抗原；,蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；,详细制备,细胞性抗原、可溶性抗原、半抗,原性抗原和免疫佐剂,新版抗体制备技术,第5页,1,、细胞性抗原制备：,绵羊红细胞（,SRBC,）,-,溶血素；,细菌,-,抗菌抗体（动物免疫血清）,2,、可溶性抗原制备：,指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞破碎、提取与纯化,1,）细胞破碎（物理法、化学法）,新版抗体制备技术,第6页,2,）提取与纯化：,超速离心分离,是一个依据分离物质比重特点，经过差速或梯度密度离心，将分子大小不一样抗原颗粒分开方法，只适宜少数大分子物质分离。,选择性沉淀,选择某抗原理化特征，采取对应沉淀剂或溶液环境例,50%,饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；,8%,12%PEG,6000,可沉淀,IgG,。,新版抗体制备技术,第7页,盐析法沉淀抗原机理,新版抗体制备技术,第8页,超滤法,利用孔径大小不一样特制薄膜对不一样分子大小抗原物质进行滤筛,层析法,包含凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，用于抗原等物质精提,电泳,（略）,3,）判定：,判定纯化蛋白含量、相对分子质量、,纯度以及免疫学活性。,新版抗体制备技术,第9页,凝胶过滤层析,(,分子筛,),作用机理,新版抗体制备技术,第10页,亲和层析作用机理,新版抗体制备技术,第11页,3,）判定：,判定纯化蛋白含量、相对分子质量、,纯度以及免疫学活性。,蛋白含量,定氮（紫外光,280nm,等）,分子质量,电泳、质谱,蛋白纯度,电泳、高效液相层析,免疫学活性,免疫双扩散、免疫印迹,新版抗体制备技术,第12页,抗原性质分析结果,新版抗体制备技术,第13页,50 000,75 000,100 000,1 2 3 4 5,Westernblot,判定三株单抗特异性,1.,分子量标准；,2.,阴性对照,:,正常小鼠血清,；,3.,纯化后,B6,与病毒上清反应；,4.,纯化后,G12,与病毒上清反应；,5.,纯化后,2B12,与病毒上清反应。,新版抗体制备技术,第14页,3,、半抗原性免疫原制备,半抗原（,hapten,）,蛋白质等载体（,carrier,）,连接,物理法：即利用电荷和微孔吸附,半抗原,化学法：利用一些功效基团把半,抗原连接到载体分子上,新版抗体制备技术,第15页,4,、免疫佐剂（,immunoadjuvant,），佐剂,指一些物质，因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体，可增强机体对该抗原物质特异性免疫应答或改变免疫应答类型。,种类,无机、生物性、人工合成、油剂和,纳米颗粒。,用途,抗原表面积增，构型改变；延长抗,原滞留时间；增强吞噬,新版抗体制备技术,第16页,（二）免疫动物,1,、免疫动物选择：,抗原起源与动物种属关系（越近越差）,动物个体选择（年纪、体重与健康，）,抗原性质与动物种类,2,、免疫方法：,免疫原剂量,免疫路径与其间隔时间,免疫动物采血,（对试验成功是否至关主要）,（,新版抗体制备技术,第17页,（三）免疫血清纯化,1,、特异性抗体纯化,1,）亲和层析,2,）吸附,2,、,IgG,类抗体纯化,1,）盐析,2,）凝胶过滤,3,）离子交换,4,）亲和层析,新版抗体制备技术,第18页,在凝胶过滤柱（,sephadex G-200,）上血清蛋白层析示意,(M=IgM,G=IgG,A=IgA),新版抗体制备技术,第19页,在,DEAE-,纤维素上人血清蛋白层析示意图,(M=IgM,G=IgG,A=IgA),新版抗体制备技术,第20页,亲和层析纯化,IgG,基础过程示意图,新版抗体制备技术,第21页,(,四,),免疫血清判定,1,、抗体效价测定（凝集、扩散、,ELISA,）,2,、特异性判定（免疫印迹、双扩散）,3,、纯度判定（,SDS-PEAG,）,4,、亲和力判定,affnity,指抗体与抗原结合,牢靠程度，以亲和常数表示。,测定方法有平衡透析、,ELISA,、竞争（非,竞争）结合等。,新版抗体制备技术,第22页,单抗亲合常数测定,：,单抗亲合常数测定采取非竞争酶免疫试验法：,1,）先确定在某一抗原浓度时抗体能够到达饱和；,2,）以该抗原浓度为试验条件，饱和时,OD,值作为,OD-100,，找出,OD-50,时抗体浓度和对应,pp65,抗原浓度；,3),依据公式,Ka=,n-1,计算,McAb,Ka,值。,2(nAbt-Ab t),t,代表测定时温度；,n=Abt/Abt,；,Abt,表示抗原浓度较高,Amax,二分之一；,Abt,表示抗原浓度较低,Amax,二分之一。,对于单克隆抗体，普通亲协力要求,107L/mol,，好单抗多大于,109 L/mol,。,新版抗体制备技术,第23页,（五）免疫血清保留,1,、,4,保留（,6,个月）,2,、低温保留（,-70,-20,，,5,年）,3,、真空干燥保留（,5,10,年）,注意点：保留前需经除菌,保留液含防腐剂,防止重复冻融（分装）,新版抗体制备技术,第24页,二、单克隆抗体制备,单克隆抗体（,monoclone antibody,，,McAb,）是由抗原致敏,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养后由一个细胞克隆所分泌只识别单一抗原决定簇纯抗体。,其理化性状高度均一，生物活性单一，高度特异及高效价特征，用于临床试验室诊疗与临床疾病治疗。,新版抗体制备技术,第25页,克隆选择学说模式图,新版抗体制备技术,第26页,单抗制备流程图,新版抗体制备技术,第27页,（一）单克隆抗体制备原理,利用杂交瘤细胞含有两种亲本细胞特征 即致敏,B,淋巴细胞分泌特异性抗体能力与骨髓瘤细胞具无限繁殖能力，从杂交瘤中经克隆化后成为单个细胞克隆并分泌抗体，称为单克隆抗体。,制备过程,致敏,B,淋巴细胞（免疫动物）,杂交细胞瘤制备、筛选,杂交瘤细胞分泌抗体确实认,分泌抗体杂交瘤细胞克隆,单克隆抗体批量生产,新版抗体制备技术,第28页,（二）单克隆抗体制备技术关键点,1,、免疫动物选择纯系,Balb/c,小鼠,2,、骨髓瘤细胞用以融合前应经过筛选,3,、细胞融合,4,、阳性克隆筛选,5,、克隆化,6,、单克隆抗体制备,7,、单克隆抗体纯化和判定,8,、单克隆抗体保留,新版抗体制备技术,第29页,（三）影响杂交瘤技术原因,1,、试剂与器材,用前必须经严格筛选，尤其血清、融合剂,2,、培养技术,预防污染，细胞培养娴熟技能,3,、早期克隆化,防止无关细胞克隆过分生长，但又应防止,克隆细胞丢失。,新版抗体制备技术,第30页,（四）单克隆抗体应用,1,、医学检验诊疗试剂,利用单抗含有特质,-,特异性与纯度高，理化性均一,2,、蛋白质提纯,将其作为亲和层析中主要配体,3,、肿瘤导向治疗帮助示踪,新版抗体制备技术,第31页,三、基因工程抗体技术,基因工程抗体（,genetic engineering antibody,）又称重组抗体，指应用,DNA,重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不一样需求进行改造和装配，经导入适宜受体细胞后重新表示抗体。,包含,：（一）人源化、小分子、双价特异,及抗体融合蛋白等。,（二）抗体库技术,新版抗体制备技术,第32页,（一）人源化抗体（,humanized antibody,）,人源化抗体指将鼠源性单抗，经过基因克隆和,DNA,重组及蛋白质工程学等技术，用人源氨基酸序列取代鼠使其保留亲本鼠单抗亲和性与特异性，但降低鼠单抗异源性利于人体内使用。,1,、嵌合抗体（,chimeric antibody,）,2,、改形抗体（,reshaped antibody,）,新版抗体制备技术,第33页,（二）小分子抗体,小分子抗体指相对分子质量比较小但含有抗原结合功效分子片段。,小分子抗体：抗原结合片段（,Fab,）、可变,区片段（,Fv,）等,优点：分子小，通透性强,原核细胞表示，成本低,不含,Fc,段，不与带,Fc,段受体反应,半衰期短，利于及时去除,新版抗体制备技术,第34页,（三）双特异性抗体,双特异性抗体,(bispecific antibody),又称双功效抗体。他含有针对两个不一样抗原位点结合特征，可同时与两种不一样抗原发生结合，不一样于天然抗体。,1,、化学交联,2,、细胞工程,3,、基因工程,新版抗体制备技术,第35页,（四）抗体库技术,抗体库技术是指用细菌克隆代替,B,细胞克隆来表示制备各种抗体（抗体谱）。,噬菌体展示,(phage display),，即用分子克隆方法将外源基因片段插入噬菌体壳蛋白非必需区，该基因表示产物与壳蛋白一起以融合蛋白形式展示于噬菌体颗粒表面。,新版抗体制备技术,第36页,新版抗体制备技术,第37页,