核酸的分离与纯化

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,核酸的分离与纯化,基本知识回顾,核酸,(nucleic acid),：以核苷酸为基本组成单位 的生物信息大分子,具有复杂的结构,DNA,重要的功能,天然存在的核酸,信息的载体,RNA,信息的储存、传递与表达,DNP-,脱氧核糖核蛋白,RNP-,核糖核蛋白,真核生物,-,染色体,DNA,和细胞器,DNA,原核生物,-,双链环装质粒,DNA,基本知识回顾,基本知识回顾,DNA,模式图,第一节 核酸分离与纯化的设计与原则,DNA,组成：,染色体,DNA,、细胞器,DNA,、质粒,DNA,。,分子总长随生物进化程度而增长,RNA,分子比,DNA,分子要小的多。,功能多样性,种类、大小、结构都具多样性,简述,DNA,与,RNA,的区别,DNA,与,RNA,性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。,一、材料与方法的选择,材料与方法的选择,临床标本繁多：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等,不同的研究目的对核酸的,完整性、产量、纯度和浓度,可能有不同的要求，还需考虑制备核酸所需的,时间与成本,，在不影响核酸质量的情况下，应选择,完全,无毒的试剂与方案。,选择原则,一是保证核酸一级结构的完整性,二是尽量排队其它分子的污染，保证样品的纯度。,保持核酸的完整性,首先，应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏（,pH,，高温）,其次，对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏（提取时间、,DNA,酶、,RNA,酶等）。,核酸的释放,DNA,与,RNA,均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的,第一步就是破碎细胞、释放核酸,。,机械法 液体剪切法,细胞的破碎方法 固体剪切法,非机械法 干燥法,溶胞法,二、技术路线的设计,机械法,主要危害高分子的线性,DNA,，此法不适全于染色体,DNA,的分离与纯化。,（,采用适宜的化学与酶能有效的裂解细胞，方法温和，能保证较高的得率和保持核酸的完整性）,核酸的分离与纯化：,利用核酸与其它物质在,一个或多个性质上的差异,设计有效方案，才能使核酸得以分离。细胞定位与组织分布上的差异,核酸与其它物质的差异：物理化学性质上的不同,各自独特的生物学特性,二、技术路线的设计,续,复杂样品,核酸分子,直接提取,核酸分子,去除污染物,非核酸的大分子污染物,非需要的核酸分子,对实验有影响的溶液与试剂,核酸分离与纯化简易图,核酸的浓缩、沉淀与洗涤,核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢,失，样品中核酸的浓度会下降,二、技术路线的设计,续,对核酸进行,浓缩,沉淀,是核酸浓缩最常用的方法,（,加入一定浓度的盐类后屏蔽磷酸基团，用有机溶剂如乙醇、异丙醇沉淀核酸,）,核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用,70%,75%,的乙醇,洗涤,去除,核酸的鉴定,1.,浓度鉴定：,可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。,紫外分光光度法,：,原理：核酸分子成分中的碱基具有一定的紫外线吸收特性。核酸的最大吸收波长为,260nm,，溶液中核酸的浓度与溶液在,260nm,紫外线下的吸光度（修正参数：,A,260,A,310,）成正比。,灵敏度：,0.25ug/ml,荧光光度法,：,原理：核酸的荧光染料溴化乙锭（,EB,）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出检红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。,灵敏度：,1-5ng,三、鉴定与保存,2.,纯度鉴定：,紫外分光光度法,DNA,：在,TE,缓冲液中，纯,DNA,的,A,260,/A,280,比值为,1.8,蛋白质（,280nm,）与酚（,270nm,）使比值下降,RNA,（,260nm,）使比值升高,RNA,：在,TE,缓冲液中，纯,RNA,的,A,260,/A,280,比值为,2.0,，但由于,RNA,二级,结构不同，其读数可能在,1.8-2.1,之间波动。,鉴定,RNA,纯度所用溶液的,pH,会影响,A,260,/A,280,读数,。,三、鉴定与保存,2.,纯度鉴定：,荧光光度法,用,EB,示踪，进行核酸电泳：,DNA,分子电泳迁移率低；,总,RNA,（三条带）：,23S,rRNA,28S,rRNA,16S,rRNA,18S,rRNA,5S,rRNA,+,tRNA,5S,rRNA,+5.8S,rRNA,+,tRNA,三、鉴定与保存,原核生物,真核生物,3.,完整性鉴定,(1),凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。,DNA,：若有降解的小分子,DNA,，电泳有脱尾,RNA,：三个条带荧光强度积分应呈特定的比值。,(2),其它方法：,三、鉴定与保存,核酸的保存,DNA,保存,：,DNA,溶于,TE,缓冲液（,pH8.0,）中在,-70,度可以储存数年；,EDTA,螯合二价金属离子，可以抑制,DNA,酶的活性；,在,DNA,样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染,小量分装保存,三、鉴定与保存,核酸的保存,RNA,保存,1.,可溶于,0.3mol/L,的醋酸钠溶液或双蒸水中,在,-70,度至,-80,度保存,2.,若以焦炭酸二乙酯（,DEPC,）水溶解,RNA,或在,RNA,溶液中加入,RNA,酶阻抑蛋白或氧钒核糖核苷复合物（,VRC),，可延长保存时间,3.RNA,沉淀溶于,70,乙醇溶液或去离子甲酰胺溶液，可在,-20,度长期保存,4.,小量分装保存,三、鉴定与保存,双链,DNA,因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子。但由于是很长的线性分子，而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。,尽管基因组,DNA,因来源、性质以及用途不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分离纯化的原则、主要步骤、主要试剂及其作用原理是一样的。,第二节 基因组,DNA,的分离与纯化,酚抽提法：,本法以含,EDTA,、,SDS,及无,DNA,酶的,RNA,酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶,K,处理后，用,pH8.0,的,Tris,饱和酚抽提,DNA,，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的,DNA,样品。,EDTA,为二价金属离子螯合剂，可以抑制,DNA,酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。,SDS,为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质。并使它们沉淀，同时还有降解,DNA,酶的作用。,无,DNA,酶的,RNA,酶可以有效水解,RNA,而避免,DNA,的消化,蛋白酶,K,则有水解蛋白质的作用，可以消化,DNA,酶和细胞中的蛋白质,酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制,DNA,酶的活性,。,pH8.0,的,Tris,溶液能保证抽提后,DNA,进入水相，而避免滞留于蛋白质层。,多次抽提可提高,DNA,纯度。一般在抽提二至三次后，移出含,DNA,的水相，作透析或沉淀处理。,酚抽提法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于,10ug,，至多到数百微克的,DNA,样品。,一、分离与纯化的方法,甲酰胺解聚法,细胞裂解与蛋白质水解步骤同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解,DNA,与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。,甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与,DNA,的复合物，还可使释放的蛋白质变性，但对蛋白酶,K,的活性无显著影响,。,由于本方法操作步骤少，尤其减少了酚的多次提取，所以获得的,DNA,分子量一般可以大于,200kb,。由于需要充分的透析，用该法制备,DNA,所需时间长而且所得,DNA,浓度低（约,10ug/ml,）,玻棒缠绕法,该法适于同时从不同的细胞或组织标本中提取,DNA,。玻棒缠绕法有两个关键步骤：一个基因组,DNA,沉淀于细胞裂解液与乙醇液的交界面，二是把沉淀的,DNA,缠绕于带铯玻棒上。通过带钩玻棒将高分子量,DNA,沉淀从无水乙醇溶液中转移到,pH8.0,的,TE,溶液重溶。制备的,DNA,分子 量大约只有,80kb,。,一、分离与纯化的方法,续,其它方法,异丙醇沉淀法,玻璃珠吸附法,将完整细胞悬浮在融化的低熔点琼脂糖中进行细胞的原位裂解与蛋白水解，然后通过漂洗去除细胞碎片，可以避免,DNA,分子在分离提取的操作中受到剪切而获得完整的,DNA,分子。,一、分离与纯化的方法,续,DNA,样品的进一步纯化,某些限制性内切酶的消化、基因克隆、转染以及基因组文库的构建等对,DNA,的纯度与完整性要求较高，此时需对,DNA,样品作进一步的纯化处理。包括透析、层析、电泳及选择性沉淀等。,聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率非常高，电泳容量比琼脂糖凝胶大，而且从聚丙烯酰胺凝胶中回收的核酸纯度很高。由于孔径较小，,PAGE,最有效的分离范围为,5-500bp,，故,PAGE,仅适合于小片段,DNA,的分离与纯化。,琼脂糖凝胶分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，可以分离大小从,50bp,到几个,Mb,的,DNA,，其中脉冲场凝胶电泳,(PFGE,）可以分离几个,Mb,的,DNA,。,一、分离与纯化的方法,续,原则与要求,1.,提高,DNA,片段的回收率,为提高,DNA,片段的回收率，可通过提高,DNA,样品的上样量和选择适宜的方法与材料而达到。在能达到一定回收率的条件下，一般选择减少回收体积的做法,。,2.,去除回收,DNA,样品中的污染,常用方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法。柱层析法采用阴离子交换层析的原理。有机溶剂抽提法和柱层析法以及其它方法最终均要在有盐的情况下进行乙醇沉淀，并以,70%,的乙醇除去有机分子与共沉淀的盐,。,二、,DNA,片段的回收,从琼脂糖凝胶中回收,DNA,片段,1.DEAE,纤维素膜插片电泳法：阴离子交换；,500bp,5kb,2.,电泳洗脱法：切胶纯化,3.,冷冻挤压法：液氮冷冻挤压；,5kb,4.,低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法：切胶纯化；,PFGE,高分子量,DNA,从聚丙烯酰胺凝胶中回收,DNA,片段,压碎与浸泡法：能较好回收,1kb,的,DNA,，回收率依分子量不同为,30-90,，,DNA,纯度高，无酶抑制剂，是小片断,DNA,回收的较好方法,。,二、,DNA,片段的回收,可行性,：,是否简便、快速、安全及成本如何,可靠性,：,稳定性、重复性、特异性、产出比、最大产量、最小样品用量等,三、基因组,DNA,分离纯化的方法学评价与质量保证,质粒是原核生物中染色质以外的遗传物质，携带的基因包括耐药性基因、毒力基因等，大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒,(CCC,plasmid)DNA,，简称闭环质粒，为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体,(Vector),第三节 质粒,DNA,的提取与纯化,包括,碱裂解法,、,煮沸裂解法,和,SDS,裂解法,等。,由细菌的培养（质粒,DNA,的扩增）、细菌的裂解（质粒,DNA,的释放）及质粒,DNA,的分离与纯化等三个步骤组成。,按制备量的不同，质粒,DNA,提取与纯化的方法可分为,质粒,DNA,的小量,(1-2ml),制备,、,质粒,DNA,的中量,(20-50ml),制备,及,质粒,DNA,大量,(500ml),制备,一、提取与纯化方法,碱裂解法,碱裂解法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。,在,NaOH,存在的强碱性,(pH 12.0-12.6),条件下，用强阳离子去垢剂,SDS,破坏细胞壁和裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与染色体,DNA,发生变性，释放出质粒,DNA,。细胞被裂解后，细胞壁碎片与变性的 蛋白质和染色体,DNA,形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下可有效沉淀，而质粒,DNA,保留于上清中。通过无水乙醇沉淀上清中的质粒,DNA,，并有,70%,的乙醇洗涤，如此制备的核酸其纯度可满足,DNA,测序与,PCR,等实验的要求。,一、提取与纯化方法,续,碱裂解法是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌,(,E.coli,）菌株中分 离出质粒,DNA,，制备量可大可小。,煮沸裂解法,将细菌悬浮于含,Triton X-