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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2,基因工程的基本操作程序,1.2基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,获取的方法？,构建目的？组成？,导入植物细胞、动物细胞、,微生物细胞的方法分别是？,如何判断目的基因是否成功导入受体细胞？,如何判断导入后是否成功表达？,基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体,一、,获取,目的基因,主要是指编码,蛋白质,的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。,目前被广泛提取使用的目的基因有：,苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因,（抗病毒、抗细菌,),、,人胰岛素基因,等。,1,、目的基因的定义,一、获取目的基因 主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以,从,基因文库,中寻找,多聚酶链式反应（,PCR,）扩增,化学合成法,目的基因的核苷酸序列,未知,目的基因的核苷酸序列,已知,（一）获取目的基因的常用方法有哪些,?,初始目的基因的来源,1.,从生物中直接获取,2.,人工合成,注意：要保持基因的完整性,从基因文库中寻找多聚酶链式反应（PCR）扩增化学合成法目的基,1,、从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（如,:cDNA,文库）,基因文库,1、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同,通过对受体菌的培养而储存基因,基因文库的构建模式图,通过对受体菌的培养而储存基因基因文库的构建模式图,由,mRNA,反转录形成,cDNA,mRNA DNA,单链,DNA,单链,RNA DNA,杂交分子,RNA DNA,杂交分子 单链,DNA,单链,DNA,双链,DNA,逆转录,使,RNA,降解,复制,核酸酶,H,?,?,形成氢键,由mRNA反转录形成cDNAmRNA,基因组文库和,cDNA,文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子,基因中内含子,基因多少,物种间基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,基因组文库和cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的,DNA,序列,.,不能够编码蛋白质的,DNA,序列,.,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶内,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术。,条件：,_,、,_,、,_,、,_,.,原理：,_,多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,模板,DNA,四种脱氧核苷酸,引物,热稳定,DNA,聚合酶,2.,利用,PCR,扩增目的基因,方式：,以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循环的次数）,结果：,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,指数,2,n,概念：PCR全称为_，是一项,过程：,变性、复性、延伸三步曲,变性：,加热至,9095,双链,DNA,解链成为单链,DNA,复性,：,冷却至,5560,部分引物与模板的单链,DNA,的特定互补部位相配对和结合,延伸：,加热至,7075,以目的基因为模板，合成互补的新,DNA,链,变性,复性,延伸,过程：变性、复性、延伸三步曲变性：加热至9095双链,过程,a,、变性,（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、复性,（,复性,55-60,）：系统温度降低，引 物与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，,合成与模板互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,过程a、变性（90-95）：双链DNA模板b、复性（复性,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原则,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA,在,高温,下变性解旋,解旋酶,催化,体外复制,细胞核内,热稳定,的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原,3.,人工合成,根据已知的氨基酸序列合成,DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,已知核苷酸序列的较小基因可以,化学合成，不需要模板。,3.人工合成根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基,从基因文库中获取,利用,PCR,技术扩增,利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,从基因文库中获取归纳：获取目的基因的方法,用一定的,_,切割,质粒，使其出现一个切,口，露出,_,。,用,_,切断目,的基因，使其产生,_,_,。,将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，,再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA,连接酶,1.,过程,:,二、基因表达载体的构建,核心,用一定的_切割 将切下的目的基因片段插入,2.,构建,目的,（,1,）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；,（,2,）使目的基因能够表达和发挥作用。,2.构建目的,3.,组成,它们有什么作用？,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,RNA,聚合酶识别和结合位点，启动转录,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,3.组成它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d,思考：,表达载体为什么一定要有启动子？,（,1,）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；,（,2,）通过,cDNA,文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。,思考：表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进行基因,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,（一）转化：,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有,（二）方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,（二）方法将目的基因导入将目的基因导入将目的基因导入农杆菌转,1.,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法,（,1,）农杆菌转化法,特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,（1）农杆菌转化法特点：原理：,转化过程,:,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色体,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,转化过程:Ti质粒构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色,基因枪法又称微弹轰击法，是,利用压缩气体产生的动力,，将包裹在金属颗粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中,，使目的基因与其整合并表达的方法。,（,2,）基因枪法,适用于,单子叶植物,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将,（,3,）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加,DNA,（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于,被子植物,（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过,2.,将目的基因导入动物细胞,（,1,）方法：显微注射法,（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到,受精卵,中）,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达,（,2,）操作程序,:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到,常用法,：,Ca,2+,处理,常用菌,：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca,2+,处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,3.,将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：过,四、目的基因的检测与鉴定,检测,:,是否插入目的基因,是否转录,是否翻译,鉴定,:,分子水平鉴定,个体生物学水平鉴定,四、目的基因的检测与鉴定检测:,1,、检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组,DNA,；,（,1,）方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:,将含目的基因的,DNA,片段用放射性同位素等作标记,以此做,探针,；,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体,DNA,中。,（一）检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先,基因探针,：,是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。,基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的,DNA,分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的,DNA,分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物,（二）鉴定（个体生物学水平）,2,、检测目的基因是否转录出了,mRNA,3,、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,:,分 子 杂 交,方法,:,抗原,-,抗体杂交,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,。,（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mR,若不能表达，要对抗虫基因再进行,修饰,。,怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？,没有抗虫基因,的棉植株,有抗虫基因的棉植株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,目的基因表达,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞,类型,步骤,检测内容,方法,结果显示,分子检测,第一步,目的基因是否进入受体细胞,DNA,分子杂交,（,DNA,和,DNA,之间）,是否成功显示出杂交带,第二步,目的基因是否转录出,mRNA,分子杂交技术,（,DNA,和,mRNA,之间）,是否成功显示出杂交带,第三步,目的基因是否翻译出蛋白质,抗原,抗体杂交,是否成功显示出杂交带,个体水平鉴定,包括抗虫、抗病的,接种实验,，以确定是否有抗性以及抗性的程度；,基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。,目的基因的表达和检测,类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受,归纳,:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,归纳:
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