基因表达载体的构建课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,2020/10/4,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,2020/10/4,#,基因工程的基本操作程序,P8,剪切,拼接,导入,表达,基因工程的基本操作程序P8剪切 拼接 导入 表达,1,目的基因的获取,方法,目的基因的获取可以,从自然界中,已有的物种中分离出来,，也可以,用人工的方法合成,。,1.,从基因文库中获取,2.,利用,PCR,技术扩增目的基因,3.,化学方法直接人工合成,目的基因的获取 方法目的基因的获取可以从自然界中已有的,2,1.,基因表达载体构建的,目的,使目的基因在受体细胞,中,，,并且可以遗传给下一代,使目的基因,能够,_,_,_,和,。,稳定存在,表达,发挥作用,1.基因表达载体构建的目的使目的基因在受体细胞中,3,2.,基因表达载体的,组成,启动子目的基因终止子标记基因复制原点,启动子,：一段特殊的,DNA,片段，位于目的基因的首端，是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。,终止子：,一段特殊的,DNA,片段，位于目的基因的尾端，使转录终止。,标记基因：,一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因，鉴别受体细胞中是否导入目的基因。,2.基因表达载体的组成启动子目的基因终止子标记基因复,4,3.,基因表达载体,构建的,过程,用产生互补末端的,酶,分别切割,载体,和含有,目的基因的,DNA,片段,，再,用,酶,把两者连接,(,如图,),。,限制,DNA,连接,3.基因表达载体构建的过程用产生互补末端的,5,3.,基因表达载体的,构建,过程,单酶切,(a,酶）,质粒重新环化,质粒与目的基因反向连接,目的基因自身环化,产生,质粒,与,质粒,的连接产物,以及,目的基因,与,目的基因,的连接产物,。,的缺点,3.基因表达载体的构建过程单酶切(a酶）质粒重新环化的缺点,6,3.,基因表达载体的,构建,过程,双酶切,(a,酶和,b,酶）优点,防止质粒重新环化,防止质粒与目的基因反向连接,防目的基因自身环化,避免质粒与质粒以及目的基因与目的基因的自身大量连接,提高正确连接的效率。,3.基因表达载体的构建过程双酶切(a酶和b酶）优点防止质粒,7,获取,目的基因,构建,表达载体,导入,受体细胞,目的基因检测鉴定,基因文库,基因组文库,cDNA,文库,PCR,变性,复性,延伸,模板、引物、,Taq,酶、,4,种,dNTP,人工合成,基因小,序列已知,获取构建导入目的基因检测鉴定基因文库基因组文库cDNA文库P,8,启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别,项目,启动子,终止子,起始密码子,终止密码子,化学,成分,DNA,片段,DNA,片段,mRNA,上三个相邻碱基,mRNA,上三个相邻碱基,位置,目的基因首端,目的基因尾端,mRNA,首端,mRNA,尾端,作用,RNA,聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出,RNA,决定转录,的结束,翻译的,起始信号,决定翻译过程的结束,知识归类,启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别项目启动子终止,9,1.,下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（）,A.,切割含抗虫基因的,DNA,片段和载体必须用同一种限制酶,B.,抗虫基因表达载体中要有启动子和终止密码子,C.,抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的受体细胞,D.,抗虫基因的表达启动于复制原点,C,1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（）,10,2.,以下为形成cDNA(图中的单链DNA)过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是(),B,A.催化过程的酶是RNA聚合酶,B.过程发生的变化是引物与单链DNA结合,C.催化过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温,D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%,2.以下为形成cDNA(图中的单链DNA)过程和PCR扩增过,11,3,.,如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst、Sma、EcoR、Apa为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是(),A.图示过程是基因工程的核心步骤,B.,抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来,C.,除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构,D.,表达载体构建时需要用到限制酶Sma,D,3.如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分,12,4.,某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Amp,r,或Tet,r,中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tet,r,表示四环素抗性基因）有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌回答下列问题：,(,1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_,（答出两点即可）,。,而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子,。,能自我复制、具有标记基因,4.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr,13,4.,某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Amp,r,或Tet,r,中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tet,r,表示四环素抗性基因）有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌回答下列问题：,（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是,_,_,_,_,；并且,_,和_,_,_,的,细胞也是不能区分的，其原因是,：,二者均不含有氨苄青霉素抗,性基因，在该培养基上均不生长,。,含有质粒载体,含有,重组质粒,_,二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长,。,在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_,_,_的固体培养基,四环素,4.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr,14,如何筛选出,插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落,？,在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，产生一些菌落，然后将这些菌落,按照原来的位置,转移到含有四环素的培养基上进行培养，一段时间后，某些菌落将会出现停止增殖的现象，这些菌落的位置在含氨苄青霉素的培养基中对应的位置的菌落即为插入了,目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落,。,如何筛选出插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落？在含有,15,1.,沈从文的创作风格趋向浪漫主义，他要求小说的诗意效果，融写实、纪梦、象征于一体，语言格调古朴，句式简峭、主干突出，单纯而又厚实，朴讷而又传神，具有浓郁的地方色彩，凸现出乡村人性特有的风韵与神采。,2.,沈从文创作的小说主要有两类，一种是以湘西生活为题材，一种是以都市生活为题材，前者通过描写湘西人原始、自然的生命形式，赞美人性美；后者通过都市生活的腐化堕落，揭示都市自然人性的丧失。,3.,从作者的描述看，作者的观察敏锐，记忆超强，对现象世界十分倾心，对大自然的声音、气味，社会上的人与事怀有浓厚的兴趣。他把大自然与社会生活称为一本“大书”，他从这本“大书”中学到了许多书本上没有的东西，他在自然和社会中倾心体验，尊重生命本真的做法，并非不爱学习，而是为了更好的学习。,4.,不少评论家觉得沈从文擅长写景，且晴朗明澈，但是缺少深度。也有评论家认为好就好在没有深度，因为没有深度的“看”风景，其实就不为一般的社会价值所局限，这样也就抛弃了自以为是的优越感和置身事外的位置，而是在宇宙万汇的动静之中“看”。,5.,一次眼光看风景万物，多了一份包涵和宽容，看到的历史也就不是战争、王朝更迭之类的东西，而是千百年来凡夫俗子们的哀乐、努力和命运。它们代表了更为现实逼真的生存和价值。,6.,抒发的感情真诚感人，不写自己的品学兼优、勤奋用功，而是如实地展现自己的天生的野性，充满了阅读和学习“生活”这本大书所得到的欢欣鼓舞的生命体验，表现了对自然和生命无比好奇和热爱以及泰然面对一切残忍和苦难的生活观。,7.,学习了这篇传记让我们了解到了沈从文从小如何“读社会这本大书”，感受到他青春期的悲欢得失。由于传主生活经历的太多苦难，加上作者在回忆中不时融入淳厚的情感，让我们读来有某种沉重与辛酸，也让我们学生受到启发：对于强者，生活中的风霜雨雪也和阳光雨露一样，都从不同侧面或者以不同的方式滋润着我们的生命，现实中的曲折、坎坷、苦难可能拓展人的精神空间，让人能更加以阔大的心胸与坚强的意志，去感受生命，理解生活的意义。,1.沈从文的创作风格趋向浪漫主义，他要求小说的诗意效果，融,16,