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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题,3,血红蛋白的提取和分离,课题3 血红蛋白的提取和分离,1,血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子氧或一分子二氧化碳，,血红蛋白因含有,血红素,而呈,红色。,血红蛋白,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁血红素基团,血红蛋白的特点：,Fe2+,血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕,2,一、基础知识,:,1,、分离生物大分子的基本思路是什么？,本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？,选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2,、蛋白质提取与分离的依据：,不同种类蛋白质的物理化学性质不同：,蛋白质形状、,大小,、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、对其他分子亲和力等千差万别。从而分离不同种类的蛋白质。,一、基础知识:1、分离生物大分子的基本思路是什么？本课题我,3,一、基础知识,-,蛋白质提取和分离原理,提取分离方法,凝胶色谱法,凝胶电泳法,3,、分离不同的蛋白质方法：,一、基础知识-蛋白质提取和分离原理 提取分离方法凝胶色谱法,4,2,、原理：,1,、材料,-,实际上就是一些微小的多孔球体。,小球内部有许多贯穿的通道,.,大多数是由多糖类化合物构成，如葡聚糖、琼脂糖。,凝胶,(,一,),凝胶色谱法,（分配色谱法）：,根据,相对分子质量的大小,分离蛋白质的有效方法,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，,相对分子质量较,小,的蛋白质：,容易进入凝胶颗粒内部的通道，路程较长，移动速度较慢；,而,相对分子质量较,大的蛋白质：,无法进入凝胶颗粒内部的通道，只能在凝胶外部间隙中移动，路程较短，移动速度较快。,2、原理：1、材料-实际上就是一些微小的多孔,5,3,、具体过程：,一、基础知识,-,蛋白质分离和提取的原理,3、具体过程：一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理,6,9,、,要学生做的事，教职员躬亲共做；要学生学的知识，教职员躬亲共学；要学生守的规则，教职员躬亲共守。,2024/11/15,2024/11/15,Friday,November 15,2024,10,、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,11/15/2024 5:19:21 AM,11,、只有让学生不把全部时间都用在学习上，而留下许多自由支配的时间，他才能顺利地学习（这）是教育过程的逻辑。,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,Nov-24,15-Nov-24,12,、要记住，你不仅是教课的教师，也是学生的教育者，生活的导师和道德的引路人。,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,Friday,November 15,2024,13,、,He who seize the right moment,is the right man.,谁把握机遇，谁就心想事成。,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,11/15/2024,14,、谁要是自己还没有发展培养和教育好，他就不能发展培养和教育别人。,15 十一月 2024,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,15,、一年之计，莫如树谷；十年之计，莫如树木；终身之计，莫如树人。,十一月 24,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,11/15/2024,16,、教学的目的是培养学生自己学习，自己研究，用自己的头脑来想，用自己的眼睛看，用自己的手来做这种精神。,2024/11/15,2024/11/15,15 November 2024,17,、儿童是中心，教育的措施便围绕他们而组织起来。,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,2024/11/15,You have to believe in yourself.Thats the secret of success.,人必须相信自己，这是成功的秘诀。,9、要学生做的事，教职员躬亲共做；要学生学的知识，教职员躬亲,7,分子量,大,小,直径大小,运动方式,运动速度,运动路径,洗脱次序,一、基础知识,-,蛋白质分离和提取的原理,大于凝胶颗粒孔隙,直径，被阻挡在颗,粒的外面,小于凝胶颗粒孔,隙直径，可以进,入颗粒内部,垂直向下移动,垂直向下移动，,无规则扩散进,入颗粒内部,较快,较慢,较短,较长,先从凝胶柱洗脱,出来,后从凝胶柱洗脱,出来,分子量大小直径大小运动方式运动速度运动路径洗脱次序一、基础知,8,1,、什么是缓冲液？,2,、缓冲液的作用是什么？,【,思考,2】:,（二）、缓冲溶液,-,在一定的范围内，凡是能够抵制,外加少量强酸或强碱,的影响使原来溶液,PH,值基本保持,不变的混合溶液。,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如,H,2,CO,3,/NaHCO,3,，醋酸,/,醋酸钠，,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,等,能够抵制,外界的酸和碱,对溶液,PH,值,的影响，维持,PH,基本不变。,洗脱剂,1、什么是缓冲液？2、缓冲液的作用是什么？【思考2】:,9,3,、缓冲液是如何配制的？,4,、本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？,通常由,1,2,种缓冲剂,溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的,使用比例,就可以制得在,不同,pH,范围内,使用的缓冲液。,磷酸缓冲液,在本课题中使用的缓冲液是,:_,其,目的,是,:,利用缓冲液模拟细胞内的,pH,环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察,(,红色,),和科学研究,(,活性,),3、缓冲液是如何配制的？4、本实验加的是什么缓冲液？为何,10,2.,原理：,(,三,),电泳,1.,电泳的概念,指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,.,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离,的基团，在一定的,PH,下，这些基团会带上正电或负电。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷,相反,的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及,分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移,速度，从而实现样品中各种分子的分离。,2.原理：(三)电泳1.电泳的概念指带电粒子在电场的作用,11,凝胶电泳原理示意图,凝胶电泳原理示意图,12,在一定,pH,下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的,SDS,，形成“蛋白质,SDS,复合物”，,SDS,所带负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使,蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。,(,三,),电泳,3.,类型,:,琼脂糖,凝胶电泳、,聚丙稀酰胺,凝胶电泳。,4,.,SDS-,聚丙稀酰胺,凝胶电泳,分离过程：,在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电,13,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,（,1,）样品处理：,包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集,到的血红蛋白溶液。,（,2,）粗分离：,透析除去分子较小的杂质。,（,3,）纯化：,通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。,（,4,）纯度鉴定：,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,为什么不用鸡的血红细胞而用哺乳动物的血红细胞作为实验材料？,二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：,14,（一）样品处理,血液,血浆,水 分,固体物质：,血浆蛋白、,无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细,胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（,90,）,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁红素基团,血液的成分,（一）样品处理血液血浆水 分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂,15,（一）样品处理及粗分离,1,、红细胞的洗涤：,（,2,）目的：,去除杂蛋白。,血液柠檬酸钠,低速短时离心,吸出上层黄色血浆暗红色红细胞液,5,倍体积生理盐水,缓慢,搅拌,10min,低速短时离心,吸出上清液,反复洗涤,直至上清液无黄色,（,1,）步骤：,柜式离心机,初次离心后的结果,3,次洗涤后的结果,？,（一）样品处理及粗分离1、红细胞的洗涤：（2）目的：,16,洗涤好的红细胞,+,蒸馏水,+,甲苯,磁力搅拌器,充分,搅拌,10min,红细胞破裂释放血红蛋白,2,、血红蛋白的释放：,蒸馏水的作用是,加入甲苯的作用是,充分搅拌的目的是,使红细胞大量吸水胀破,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,搅拌器转子,磁力搅拌器,搅拌器正在工作,洗涤好的红细胞+蒸馏水+甲苯磁力搅拌器充分搅拌10min,17,3.,分离血红蛋白,分离过程,红细胞,混合液,中速离心,10min,离心管,滤纸,过滤,脂类物质,烧杯,红细胞破碎混合液转移离心管中中速长时离心（,2000r/min10min,）滤纸过滤除去脂质分液漏斗静置片刻分出下层的,红色透明液体,。,3.分离血红蛋白分离过程红细胞中速离心离心管滤纸过滤脂类物质,18,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,分离血红蛋白溶液有机溶剂 无色透明的甲苯层脂类物质,19,20mmol/L,磷酸缓冲液,1mL,1mL,4,、透析（粗提取）：,取,1ML,血红蛋白溶液装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（,PH,为,7.0,）透析,12,小时。,透析袋：小分子自由通过，而大分子保留在袋内。,去除小分子的杂质,20mmol/L磷酸缓冲液4、透析（粗提取）：取1ML血红蛋,20,利用透析袋透析,利用透析袋透析,21,透析过程,透析过程,22,（二）纯化凝胶色谱操作,1.,凝胶色谱柱的,制作,：,2.,凝胶色谱柱的,装填,：,3.,样品的,加入和洗脱,（二）纯化凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱,23,（二）凝胶色谱操作,1,、凝胶色谱柱的制作：,取长,40,厘米，内径,1.6,厘米的玻璃管，,两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞,打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好，插到玻璃管的,一,端,。,顶塞的制作：,打孔安装玻璃管,。,组装：,将上述三者按相应位置组装成一个整体,。,安装其他附属结构。,如,P,68,图,5-19,注意事项：,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的,凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋,白质分离不彻底。,（二）凝胶色谱操作1、凝胶色谱柱的制作：如P68图5-19,24,材料：交联葡聚糖凝胶,G-75,；,20mmol/L,磷酸缓冲液,装填,:,2.,凝胶色谱柱的装填：,步骤,操作要求,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡,12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液2.,25,注意：,1,、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间,的空隙。,3,、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气,泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物,质的分离效果。,2,、装填凝胶柱时不得有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,4,、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,注意：3、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气,26,装配好的凝胶柱,如图,5-21,装配好的凝胶柱如图5-21,27,3.,样品加入与洗脱,调节缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,滴加透析样品：,吸管吸,1ml,样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,样品渗入凝胶床：,加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭
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