细胞生物学实验技术(三)课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节 细胞实验技术,第四节 细胞实验技术,一、细胞核染色,细胞核染色用途,计数,支原体检测,分裂指数检测,主要是作为一种参照，免疫组化检测蛋白质、核基质或者细胞质骨架等,一、细胞核染色细胞核染色用途,细胞核染色,实验室常用的核染色剂有三种,PI:,碘化丙啶,（,propidium iodide,）,不能通过活细胞膜,，所以,活细胞不能被染色,，发,红色荧光,Hochst33342,和,Hochst33258,两种,能穿过细胞膜,，发蓝色荧光，可以染色活细胞和固定的细胞,Hochst33342,有更强的亲脂性，更容易穿过细胞膜,支原体检测通常用,Hochst33258,DAPI,:dihydrochloride,可穿透细胞膜的,蓝色,荧光染料,细胞核染色实验室常用的核染色剂有三种,DAPI,染色的细胞核,PI,染色,DAPI染色的细胞核PI染色,Hochst,染色的细胞,Hochst染色的细胞,用抗,-tubulin,抗体染色显示微管,(,绿色,);,细胞核,:,红色,PI,染色,(,激光共聚焦显微镜照片,),生物论坛,用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:,细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓,，部分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。,支原体污染表现,荧光染料,Hoechst33258,染色法检测支原体,细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发生脱落等,细胞核染色用途,计数,支原体检测,分裂指数检测,主要是作为一种参照，免疫组化检测蛋白质、核基质或者细胞质骨架等,细胞核染色用途,二、免疫组织化学技术,免疫组织化学技术,是应用,免疫学基本原理,抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质,定性,和,定位,的组织化学技术。,按照标记物的种类可分为：,免疫荧光法、,免疫酶法,，,免疫铁蛋白法,免疫金法,放射免疫自影法等。,二、免疫组织化学技术免疫组织化学技术 是应用免疫学基本原理,用抗,-tubulin,抗体染色显示微管,(,绿色,);,细胞核,:,红色,PI,染色,(,激光共聚焦显微镜照片,),生物论坛,用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:,原 理,原 理,免疫荧光法可分为以下三种,1,直接法,2,间接法,3,双重免疫荧光法,免疫荧光法可分为以下三种 1直接法 2间接法 3双重,1,直接法,用,荧光素,标记的,特异性抗体,直接与相应的,抗原,结合，以检查出相应的抗原成分。,1直接法 用荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，,2,间接法,先用一级抗体（特异性抗体）与相应的抗原结合，再用荧光素标记的二级抗体（间接荧光抗体）与一级抗体相结合，形成,抗原,一,特异性抗体,一,间接荧光抗体,的复合物。,在此复合物上带有比直接法更多的荧光抗体，所以，此法较直接法灵敏。,2间接法 先用一级抗体（特异性抗体）与相应的抗原结合，再,3,双重免疫荧光法,同一样品需要检测两种抗原时，可利用不同颜色的荧光素分别标记。,3双重免疫荧光法 同一样品需要检测两种抗原时，可利用不同,抗体（,antibody,）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由,B,淋巴细胞,或,记忆细胞,增殖分化成的,浆细胞,所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的,免疫球蛋白,。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中,对于相同的物种，抗体的结构即相似又有不同。,抗体（antibody）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋,细胞生物学实验技术(三)课件,抗体是具有,4,条多肽链的对称结构，其中,2,条较长的重链（,H,链）；,2,条较短的轻链（,L,链）。,轻链有,和,两种，重链有,、,、,、,和,五种。,整个抗体分子可分为,恒定区,和,可变区,两部分。,在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。,可变区位于“,Y”,的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称,高变区,。,高变区位于分子表面，最多由,17,个氨基酸残基构成，少则只有,2,3,个。,高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性,。,一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片（,antigen-binding fragment,Fab,）。,Y,的柄部称结晶片段（,crystalline fragment,FC,），糖结合在,FC,上。,抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长的重链（H链）；,标记的二抗是抗某个物种,球蛋白,抗体，有,种的特异性,，如抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，二抗是,普适抗体,，用于该物种所有一抗。,标记的二抗是抗某个物种球蛋白抗体，有种的特异性，如抗鸡血清球,细胞生物学实验技术(三)课件,间接法,间接法一抗和二抗的选择：通常选择,异源抗体,，,比如，,检测的是小鼠,一抗,：大鼠，兔，羊（一抗是特异的抗体）,二抗,：,X,抗大鼠、,X,抗兔、,X,抗羊（普适抗体）,小鼠,OCT4,蛋白,-,OCT4,一抗（大鼠）,-,兔抗,大鼠二抗,小鼠,Nanog,蛋白,-,Nanog,一抗（大鼠,）,-,羊抗,大鼠二抗,间接法间接法一抗和二抗的选择：通常选择异源抗体，小鼠OCT4,胚胎干细胞,胚胎干细胞,Oct-4 staining,Oct-4 staining,免疫双标二抗的,封闭血清,选择和二抗的,种属来源,选择,组织：小鼠一抗：,A,（大鼠抗小鼠），,B,（兔抗小鼠）二抗：,A,（羊抗大鼠），,B,（羊抗兔）这种是最常见的，也是最简单易行的。此时做荧光双标较理想，如二抗,A,选择羊抗小鼠的,Cy2(,绿光,),二抗,B,选择羊抗兔的,Cy3,（红光）。一般来说，此种情况下，两个一抗可以一起孵育，两个二抗也可以一起孵育。封闭液就选择针对二抗的羊血清。一般是用,10%normal goat serum 30min 37,度。这种情况 选 羊的 或者驴血清 都可以。,1.,免疫双标做得好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应,2.,封闭液的选择 封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。比如，二抗是“驴抗羊,FITC,、驴抗兔,CY3”,，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液,免疫双标二抗的封闭血清选择和二抗的种属来源选择 组织：小鼠,细胞生物学实验技术(三)课件,1/1000,的明胶,1/1000的明胶,免疫荧光基本实验步骤：,（,1,）,细胞准备。,在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的,盖玻片,的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，,（,2,）,固定,。通常用,多聚甲醛,固定细胞。固定的目的,杀死细胞，并保持细胞完整的结构,，多聚甲醛通常,通过自由氨基酸基团,形成分子间桥连,，从而产生一种相互连接的,网络结构,。交联剂比有机溶剂更易于,保持细胞的结构,。,（,3,）,通透,。通透通常选用,TritonX,100,。通透剂一般都是去垢剂，它,能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性,。，通透的时间一般在,5-15min.,通透后用,PBS,洗涤,35 min.,（,4,）,封闭。,封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，通常使用,BSA,（牛血清白蛋白）,（,5,）,一抗结合,。室温孵育,1h,或者,4,过夜。,（,6,）,二抗结合,。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育,（,7,）,封片及检测,。滴加封片剂（防淬灭剂）一滴，封片，荧光显微镜检查。,免疫荧光基本实验步骤：,常用的荧光素,异硫氰酸荧光素,（,fluoreceinisothiocyante,，,FITC,），分子量为,389,，最大吸收光谱为,490,495,，最大发射光谱为,520,530urn,，呈,绿色荧光,，是最常用的标记抗体的荧光素。,四甲基异氰酸罗达明,（,tetrametrylrhodarnineisothiocyante,，,TRITC,）是罗达明（,rhodamine,）的衍生物。最大吸收光谱,550urn,，最大发射光谱,620urn,呈,橙红色,荧光，与,FITC,发射的绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。,常用的荧光素异硫氰酸荧光素（fluoreceinisoth,免疫荧光法优缺点,优点,：具有抗原抗体反应的,特异性,，染色技术的,快速性,，在细胞或组织上定位的,准确性,，以及荧光效应的,灵敏性,等优势。,缺点,：由于免疫荧光法必须具有,荧光显微镜,，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果,不易长期保存,等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。,免疫荧光法优缺点优点：具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快,Oct-4 staining,Oct-4 staining,用抗,-tubulin,抗体染色显示微管,(,绿色,);,细胞核,:,红色,PI,染色,(,激光共聚焦显微镜照片,),生物论坛,用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:,四、细胞爬片,1,先用自来水冲洗，,2,再泡酸,24,小时，,3,自来水洗掉残留酸后，双蒸水洗,3,遍，,4,再用,100,酒精泡过夜,5 37,度烘箱烘干，,6,烘干后的玻片放培养皿中高压消毒灭菌即可用了。操作时要一片一片来，不然很容易粘在一起取不下来。如果想促进细胞贴壁，可以用鼠尾胶原或者多聚赖氨酸处理。如果经费充裕，可以考虑买,fisher,的产品。,四、细胞爬片1先用自来水冲洗，2再泡酸24小时，3自来水,1/1000,的明胶,1/1000的明胶,三、细胞核型分析,目的,基因物理定位,遗传疾病诊断,亲缘关系判定,细胞是否异常,三、细胞核型分析目的,核型模式图,核型模式图,五、细胞核型分析,操作,中期细胞的获得：,培养的细胞或者组织中分离的细胞（秋水仙素）,低渗：,Kcl,固定：甲醇：冰乙酸（,3,：,1,）,滴片,染色：,Gimsa,镜检,分析或计数,五、细胞核型分析操作,六、细胞活力测定及计数方法,培养的细胞在一般条件下要求有一定的,密度,才能生长良好，所以要进行细胞计数。,计数结果以每毫升细胞数表示,。,总细胞中活细胞所占的百分比叫做,细胞活力,，,由,组织中分离细胞,一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。,复苏后的细胞,也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,利用,染料会渗入死细胞,中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之,trypan blue(,台盼蓝,),染料，如果细胞不易吸收,trypan blue,，则用红色之,Erythrosin bluish,。,现在也有,PI,和,Hochst,，,PI,不能透过活细胞膜，但是,Hochst,可以。,六、细胞活力测定及计数方法 培养的细胞在一般条件下要求有一定,染色死细胞,染色死细胞,细胞计数,方法,血细胞计数板,流式细胞仪,细胞计数方法,细胞密度（个,/ml,）（,4,个大格细胞总数,/4,）,10,（,10,的,4,次方）,每个大正方形之体积为,1.0 x 10 ml,操作：,1.,把细胞制成合适浓度的悬液，充分混匀后立即观察。,2.,把洗干净并且干燥的计数板和盖玻片放好，盖玻片放在计数板上。,3.,取细胞悬液，滴在盖玻片边缘，让悬液渗进去,注意：,1,，压线的细胞记上不记下、记左不记右,2,，抱团的细胞记成一个,3,，抱团的细胞超过,10%,需重新打散后再记,4,-4,细胞密度（个/ml）（4个大格细胞总数/4）10（10的,细胞计数板获得的细胞数目的结果是,大概的值,，要想,绝对计数,需要使用,流式细胞仪,。,流式细胞仪（,flow cytometer,）,流式细胞仪是对,悬浮状态,的细胞,逐个计数,并记录其,有关参数,的细胞分析仪器,因其测量速度快,在很短时间内可以分析大量细胞,并能测出多个参数,在临床上有广泛的应用,流式细胞仪能测