第三章 酶和细胞的固定化技术及其应用

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 酶和细胞的固定化 技术及其应用,酶的概述,具有高效和专一催化功能的生物大分子，包括蛋白质和核酸两类。,酶调控着新陈代谢，是生命活动的根底。,反响条件温和,催化效率特别高,具有高度的专一性绝对专一性、相对专一性、立体异构专一性,酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。,但在使用过程中，人们也注意到酶的一些缺乏之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反响后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。,为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。,酶的固定化,固定化酶是一种在空间运动上受到完全约束或局部约束且仍具有活性的酶。,近代工业化利用始于1969年固定化氨基酰化酶的应用。,利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物别离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速开展。,其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。,酶固定化的优点,同一批固定化酶能在工艺流程中重复屡次地使用,固定化后，和反响物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤。,可长期使用，并可预测衰变的速度。,提供了研究酶动力学的良好模型,可以提高生物反响器的选择范围,多数情况下，热稳定性、操作稳定性、储存稳定性及pH稳定性提高。,载体和固定化方法,固定化酶性质,目标要求、反响器特点、各局部特性,载体选择的原那么,必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催化反响取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。这就要求酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位,由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，防止那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理。,酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。,固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。,固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应尽可能不阻碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。,固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反响液发生化学反响。,固定化酶的本钱适中。工业生产必须要考虑到固定化本钱，要求固定化酶应是廉价的，以利于工业使用。,常用固定化材料,无机材料,有机材料,生物材料,碳酸钙,聚乙烯醇,纤维素,氧化铝,聚乙烯,葡聚糖,活性炭,尼龙,海藻酸盐,新型固定化载体,纳米材料,磁性微球,等离子体材料,固定化方法,酶的固定化方法主要可分为五类：吸附法、包埋法、微囊法、共价键结合法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。,吸附法,吸附法是固定化方法中最简单的方法。,吸附法adsorption是通过载体外表和酶分子外表间的次级键相互作用而到达固定目的的方法。,酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。,吸附法又可分为物理吸附法和离子交换吸附法。,物理吸附法,物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体外表上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法，如-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化。,物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。,离子交换吸附法,离子吸附法(ion adsorption)是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、,-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。,如最早应用于工业化生产的氨基酰化酶，就是使用多糖类阴离子交换剂二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖凝胶固定化的。此外，DEAE-纤维素吸附的,-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。,吸附法固定酶的优缺点？,载体中酶蛋白的解吸脱落和非专一性吸附是比较严重的问题。,蛋白质在载体上的吸附和解吸与以下因素有关：,pH、盐、酶浓度、温度、吸附速度、载体,共价结合法,共价键结合法(covalent binding是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。,酶蛋白N末端的-氨基或赖氨酸残基的-氨基。,酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。,半胱氨酸残基的巯基。,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。,组氨酸残基的咪唑基。,色氨酸残基的吲哚基。,苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。,其中最普遍的共价键结合基团是氨基、羧基以及苯环。,常用来和酶共价偶联的载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。,这种方法是固定化酶研究中最活泼的一大类方法，但必须注意，参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性非必需基团，如假设共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。,载体活化方法,重氮法 是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。,叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。,溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。由于该法可在非常缓和的条件下与酶蛋白的氨基发生反响，近年来已成为普遍使用的固定化方法。,主要优缺点,优点：,酶和载体之间的连接很牢固，不会发生酶的脱落，稳定性较好。,缺点:,载体的活化或固定化操作比较复杂，反响条件也比较剧烈。,假设共价结合包含酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。,包埋法,它是一种用物理方法将酶包埋在高聚物内，反响条件温和并且不改变酶结构的固定化方法。,材料有聚丙烯酰胺、三醋酸纤维、淀粉、硅胶、血纤维和胶原等。,微囊法,有时候被称为包埋法的一种,酶或细胞是游离的，但限制在一定的空间。悬浮液被包裹在膜内，使酶存于类似细胞的环境中，阻止了酶的脱落。小分子底物那么能迅速通过膜与酶作用，产物扩散出来。,常用尼龙膜、醋酸纤维素等。,需要控制反响速率和反响器参数以适应微囊法的应用。,交联法,交联法cross-linking是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。,由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反响，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反响时间将有利于固定化酶活力的提高。,常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯和N,N-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等，其中使用最广泛的是戊二醛。,常参加白蛋白或明胶作空间间隔；与其它固定方法联用。,酶的稳定性,固定化酶对热、各种变性剂的耐受性增强，稳定性提高。,固定化酶稳定性提高的原因：,酶分子与载体多点连接，可防止酶变形；,酶活力的缓慢释放；,抑制酶的自降解；,固定化酶的性质,最适温度,固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。,由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高。,影响固定化酶最适pH因素主要有两个：,载体的带电性质；,负电的载体固定化酶，最适pH比游离酶高；,正电的载体固定化酶，最适pH比游离酶低；,电中性的载体固定化酶，最适pH一般不改变。,酶催化反响的产物性质。,产物为酸性时，固定化酶的最适pH比游离酶高；,产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低；,产物为中性时，最适pH一般不改变。,固定化酶的活性,固定化酶的活性较水溶性酶有所下降,原因：,酶分子空间结构的变化，影响活性中心氨基酸。,空间位阻影响底物与酶的定位作用。,外扩散和内扩散阻力影响底物与酶的接触。,个别固定化酶活力增强可能是酶得到化学修饰或稳定性增加。,共价结合法由于反响剧烈，最容易改变酶蛋白构象，对酶活性影响很大。,载体材料可通过影响反响组分的分配效果而改变固定化酶的反响活性。,提高搅拌速度、加快流体流动可以改善外扩散限制。,细胞固定化,将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。,被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。,一般采用对细胞伤害较小的吸附法和包埋法。,特点：,密度大、可增殖。,提高生产能力，缩短发酵周期。,稳定性高，可反复利用。,有利于产品别离纯化。,吸附法固定细胞,采用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其外表而使细胞固定化的方法称为吸附法。,吸附法是细胞固定化中使用最广泛的方法。,优点：操作简便、本钱低、可再生、固定化载体选择范围广。,缺点：稳定性差,包埋法固定细胞,应用广泛，采用海藻酸钙等固定活细胞、增殖细胞效果好。,适用于底物和产物分子量较小。,固定化细胞分类,固定化细胞分类：微生物细胞,植物细胞,动物细胞。,活细胞：固定化静止细胞 不生长，休眠,固定化增殖细胞 生长发酵,固定化死细胞：酶,固定化细胞的性质,与固定化酶和游离的细胞比较：,目的产物的产量提高高密度生长。,克隆基因产物的表达连续操作。,质粒遗传稳定性P+和P-细胞无法在胶粒中竞争。,固定化技术的应用,利用固定化微生物生产各种产物，如酒精、氨基酸、有机酸、酶和辅酶以及抗生素等。,利用固定化微生物细胞(酶)制造生物传感器,药物控释载体,