免疫组化的原理与操作-PPT

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组织化学,Immunohistochemistry,概念：,免疫组织化学,(Immunohistochemistry,IHC),是利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也叫原位免疫学（,In situ immunology,）。,特点或优点：,（,1,）特异性强、灵敏度高；,（,2,）可定性、定位、定量观察；,（,3,）将形态学改变与功能和代谢变化结,合起来；,免疫组化概述,IHC,不仅具有传统形态学（包括,LM,和,EM,水平）能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能定位的缺点。,IHC,则可在原位和固相对染色结果进行观察。目前,IHC,的定位可精确到亚微结构水平。,随着,IHC,技术的发展和图象分析技术的发展，,IHC,已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，使,IHC,在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于研究，也用于诊断。,IHC,与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术（,in situ hybridization,，,ISH,）,既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。,IHC,技术源于免疫荧光术（,immunofluorescence,IF,），从,1941,年,1950,年,Coons,等用了,10,年首创了,荧光素标记抗体技术,检测肺组织内的肺炎双,球菌,，六、七十年代,IF,在科研中占据着主导地位,1968,年中根一穗（,Nakane,）等创建了,酶标抗体技,术,（,immunoperoxidase,，,IPO,）,铁蛋白标记,Ab,技术,;,1974,年,Stemberger,改良上述技术，建立,辣根过氧,化物酶抗体过氧化物酶,（,PAP,）技术，使免疫,细胞化学得到广泛应用,；,一、,IHC,的发展简史,80,年代,Hsu,等建立了,ABC,法,之后，免疫金,银染色,法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。,90,年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细,胞化学分类方法迅速发展；,2000,年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组,化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合,研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个,学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技,术之一；,国内起步晚，从,70s,开始。,（一）方法学,1.,从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）亲和反应。新的亲和物质对有：,生物素与卵白素,（,biotin&avidin),，葡萄球菌,A,蛋白（,SPA,）与,IgG,，凝集素与受体，激素与受体。这些亲和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学（,affinity histochemistry,），,这些方法,特异性、敏感性、稳定性高，更方便、适于某些特殊观察（如,EM,）。,2.,从单一显示某种物质（单标记）显示多种物质（双标记）。,3.,从,LMEM,（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。,4.,从定性定量，图象分析（,IA,）、流式细胞术（,FCM,）。,5.IHC,与,ISH,相结合，可在不同水平检测,DNA,、,mRNA,、,protein,。,6.,原位,PCR+IHC,可在组织原位通过扩增检测微量目的,DNA,。,7.,趋于标准化、自动化。,二、,IHC,的现状和发展前景,（二）技术分类,1.,根据染色方式分成：贴片染色,漂浮染色,2.,根据,Ag-Ab,结合方式分成：,直接法,间接法,多层法,3.,按标记物的性质分成：,免疫荧光技术（免疫荧光法）,免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、,PAD,法、,ABC,法）,免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色,法、蛋白,A,金法）,（三）标记物,1.,必要性：组织细胞内,Ag-Ab,结合反应一般是不可,见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。,2.,常用标记物,荧光素,：最常用的是异硫一氰酸荧光素（,Fluorescein isothiocyanate,，,FITC,）,-,荧光显,微镜下呈绿色荧光,;,四乙基罗达明（,rhodamine,RB200,）,-,荧光显微镜下发橙红色荧光,酶,：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。,生物素,：（,Biotin,）,铁蛋白金,等：主要应用于免疫电镜。,其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）,（,四,）,IHC,的应用,1.,只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫等）、皮肤病学、器官移植等。,2.,可用于多种材料：,A.,各种组织（冰冻组织、,formalin,固定组织、石蜡包埋组织兼可）；,B.,各种细胞(穿刺、体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。,3.,用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。,4.,用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研究生常用,IHC,，,或,IHC+,分生技术,；,最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。,（一）标本的收集与处理,IHC,染色成功与否及其质量如何，除染色方法本身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、固定、脱水、包埋、切片等。,目的：保存好,Ag,的数量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。,材料的来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固定的。,1,、组织标本的取材与储存,来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。,要求：要快、要小（,110.4cm,），避免挤压。,处理：冰冻即用或保存；固定即用或保存。,三、样品的准备、处理,2,、细胞标本的取材与储存,来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。,处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；,细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；,对于体外培养细胞：,贴壁生长,细胞（内皮,C,、纤,维,C,、神经,C,等）在培养皿底置载玻片；,悬浮生长,细胞,需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。,（二）固定（,fixation,）,1,、固定的含义,固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免,Ag,溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结构。,根据,Ag,对固定剂的耐受性，可将其分为：,不稳定,Ag,（如细胞表面,Ag,，不耐甲醛，宜用丙酮）、,半稳定,Ag,及稳定,Ag,，后二者多为蛋白、肽类、酶类物质。,固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联过度，封闭,Ag,。,2,、常用固定剂及其用途,1.10%,的,formalin,（,4%,的甲醛,formaldehyde,）：以,pH7.4,的,PBS,配制，,优点,：穿透力强、固定快、组织收缩小；,适于,固定蛋白、肽类、酶、糖。,IHC,常用,4%,多聚甲醛,polyformaldehyde,灌注固定及后固定，,时间,46 h,。,2.2.5%,的戊二醛，同上。也可用,2%,戊二醛与,2%,多聚甲醛混合液固定，尤对,超微结构,保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭抗原，必要时需抗原修复。,3.70%,的酒精（乙醇），,优点,：固定蛋白好，,缺点,：组织收缩严重；,时间,：,2h,。,4.70%,丙酮，,优点,：渗透快；,缺点,：对形态保存不好；,用于,对冰冻切片和细胞涂片的固定；,时间,：,10min,。,5.,混合固定液：,Bouin,液：,40%PF250ml,、冰醋酸,50ml,、饱和苦味酸,250ml,；还有,PLP,固定液，较适合免疫组化。,6.,四氧化锇（,OsO,4,锇酸）：常用,PBS,配制,1%,锇酸溶液后固定,1h,，用于免疫组化及电镜观察。,有强烈刺激，需在通风橱内操作,。,（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片,前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片不需此步骤。,切片可分为：,石蜡切片,：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,57m,；,冰冻切片,：浸糖，,20%30%,蔗糖,4,o,C,过夜，减少冰,晶；,OCT,包埋；液氮速冻，减轻组织破,坏。病理切片要薄，,57 m,；脑片通常,3050 m,厚。,振动切片,：不需做任何包埋，固定后的组织可直接,用振动切片机做各种厚度的切片，并在,染色后可进一步制作电镜标本观察。,（四）防脱片剂,（,1,）,蛋白甘油，蛋清与甘油,1,：,1,搅拌、过滤、防腐；,（,2,）,1%,的铬矾明胶涂片；,（,3,）,0.1%,的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。,配制时用塑料,瓶而不能用玻璃瓶,；,（,4,）,购买商品化的进口,硅化玻片,；,（,5,）,APES,（氨丙基三乙氧基硅烷），,1,：,50,丙酮稀释，,浸片,2030,秒，晾干备用；,贴片时要一步到位。,（五）抗原修复,近年兴起的新技术。目的：,暴露被交联封闭的,Ag,。主要适用于经长期,formalin,固定的标本、石蜡包埋标本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：,（,1,）,微波加热,切片煮沸,1020min,，室温自然冷却，所用溶液有：饱和,NaCL,溶液；,10mMpH 6.0,的枸橼酸钠缓冲液；,4M,的尿素等；,pH8.0TBS;,（,2,）高压锅处理,将切片放入,10mM,、,pH 6.0,的枸橼酸钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气,310min,，自然冷却。,（,3,）酶消化处理,：常用,0.1%,的胰蛋白酶（含,0.1%CaCL,2,，,pH 7.8,）,37,。,C 10min,。或,0.4%,胃蛋白酶,37,。,C 30min;,（一）基本染色方法,荧光素标记抗体：,FITC,、,直接法,TRITC,等,标记抗体法,酶标记抗体：,HRP,、,AP,等,荧光素标记抗体,间接法,酶标记抗体（三步法）,非标记抗体法：,酶桥法、,PAP,法,、,APAAP,法,;,亲和组化法：,ABC,法,、,LAB,法、,LsAB,法、,BRAB,法,;,双重标记：,阻断法（酸洗,抗）、非阻断法（连续染）,四、,免疫组织化学技术,1,直接法,荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察检测抗原。,优点,：简单，时间短，,特异性强。,缺点,：灵敏度低，所,需抗体量大,（不经济）。,应用,：基本不用了！,2,间接法,荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的,IgG,抗体）。,显色后镜检,特点：,1,、敏感性较直接法高,3-4,倍，但,特异性较低,；,2,、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；,3,、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用,PBS,代替一抗做空白对照。,3,非标记,Ab,桥法：,“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。,（,1,）单桥法,(2),双桥法,在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，,可增大染色强度。,特别提示：注意动物种属关系,特点：,敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非特异性结合的酶不易洗去，背景染色重,。,4,过氧化物酶,抗过氧化物酶法（,Peroxidase,anti-,peroxidase,method,，简称,PAP,法）,是桥法的改良，用第二抗体作,“,桥梁,”,，先与第一抗体结合，,再与,PAP,复合物联结，形成,抗原,抗体,抗,IgG,抗体,PAP,复合物,，最后用底物显色剂显色。,特点：,灵敏度高，比间接荧光法敏感,20,倍，比间接酶标记抗体法敏感,100,倍,5,亲和素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物法（,avidin-biotin-,peroxidase complex technique,，简称,ABC,法）。,关键的程序步骤为,3,步：,Ag+,Ab1,+,（,Ab2-B,）,+,ABC,复合物,（,Ab2-B,为生物素标记的第二抗体）,（,B,为生物素标记的过氧化物酶）,ABC,复合物是,avidin,与酶联,biotin,在使用前,3