细胞融合定稿

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,鸡血细胞的体外融合,细胞融合,又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。,细胞融合的应用领域,细胞融合（,cell fusion),是细胞工程技术的重要手段之一，是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。,显微镜下细胞融合过程,融合过程中两个细胞膜从彼此接触,到破裂形成细胞桥的变化过程图解,融合的助融剂,依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：,病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（,HVJ,）；,化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（,PEG,）；,电场诱导的细胞融合；,激光诱导的细胞融合,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,实验目的,了解聚乙二醇（,PEG,）诱导体外细胞融合的基本原理。,通过,PEG,诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。,实验原理,PEG,是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。,商品,PEG,存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用,PEG40006000,的溶液，能够产生高频率的细胞融合。,PEG,诱导融合的特点,优点：,是融合成本低，勿需特殊设,备；融合子产生的异核率较,高；融合过程不受物种限制。,缺点：,是融合过程繁琐，,PEG,可能,对,细胞有毒害。,聚乙二醇（,PEG,）法细胞融合过程,实验仪器、用具,注射器,滴管,烧杯,容量瓶,载玻片,离心机,水浴锅,显微镜,酒精灯,盖玻片,试剂,Hanks,原液（,10,）,NaCl2 80.0g,Na2HPO4,12H2O 1.2g,KCl 4.0g,KH2PO4 0.6g,MgSO4,7H2O 2.0g,葡萄糖,10.0g,CaCl2 1.4g,试剂,Hanks,原液（,10,）,称取,1.4gCaCl2,，溶于,30-50ml,蒸馏水中,取,1000mL,的烧杯及容量瓶各,1,个，先放重蒸水,800mL,于烧杯中，然后按上页表顺序逐一溶解药品。直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的,CaCl2,溶液加入，最后加水定容至,1000mL,试剂,Hanks,液,Hanks,原液,100mL,重蒸水,896mL,0.5%,酚红,4mL,配好的,Hanks,液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，,4,保存。,试剂,生理盐水,50%,（,m/V,）,PEG,溶液,称取,0.5,克,PEG(MW=4,000),放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入,1ml,预热的,Hanks,液混匀制成,50,的,PEG,溶液。放入,37,水浴中待用。,方法与步骤,1.,鸡血细胞储备液的制备（已完成）,取鸡血，加入肝素（,100U/5mL,全血）制成抗凝全血。再加入,4,倍体积生理盐水，制成红细胞储备液,2.,鸡血细胞的处理,用,5mL,离心管取鸡血细胞储备液,1mL,，加入,4mL,生理盐水，混匀后，,800rpm,离心,5min,，弃上清，用,5mL,生理盐水重悬浮沉淀，重复离心操作,1,次。,方法与步骤,3.,鸡血细胞悬液的制备,在离心后的鸡血细胞沉淀中加入,2ml,Hanks,缓冲液，将细胞悬浮，,于,37,保温。,4.PEG,诱导细胞融合,吸取,1mL,鸡血悬液放在,10,mL,离心管中，逐滴加入,37,的,50%PEG,约,0.5mL,边加边轻轻摇动，,1min,加完，混匀后于,37,水浴静置,3min,。,方法与步骤,5.,终止,PEG,作用,缓慢加入,5mL,Hanks,缓冲液，轻轻吹打混匀，于,37,水浴中静置,5min,。,6.,制备细胞悬液,用吸管轻轻吹打细胞团数次使其分散，离心使细胞沉淀，用,1-2mL,Hanks,缓冲液重悬浮。,7.,镜检,吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。,注意事项,温度、融合时间、,PEG,的浓度与作用时间、细胞密度、机械力等因素均影响融合率，实验操作时应予以注意，并在需要的时候及时镜检。,实验结果,计算细胞融合率,细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合细胞的细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总数之比，通常以百分数表示。,测定时要进行多个视野计数，并进行统计分析。,作业,1.,画出观察到的融合细胞。,2.,并计算融合率。,