研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Rubisco,和,Rubisco,活化酶抗体的制备及其在作物中的应用,研 究 生,:,陈 相 辉,导 师,:,王忠教授,专 业,:,植 物 学,一、研究目的和意义,Rubisco,（,1,5-,二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶，,ribulose-1,5-bisphosphate,carboxylase/oxygenase,）,是光合碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起着决定性作用。本课题拟以小麦为实验材料，采用,ELISA,测试技术，研究,Rubisco,和,Rubisco,活化酶的特性，这些结果将有助于进一步阐明,Rubisco,及,Rubisco,活化酶的作用机制，为最终提高作物的光合产量提供理论依据。,二、选题依据,Rubisco,和,Rubisco,活化酶的特性一直是光合作用研究的热点问题，如何提高作物中这两种酶的含量和活性也一直是个悬而未解决的难题。目前，国内外多以烟草、菠菜作为研究,Rubisco,和,Rubisco,活化酶的材料，涉及小麦和水稻等作物方面的内容较少，尤其有关小麦,Rubisco,活化酶的研究仍然是国内外研究中的空白。,创新之处,本实验利用免疫化学技术提供一个快速、准确而简易的定量测定,Rubisco,和,Rubisco,活化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量的变化。进一步对,Rubisco,和,Rubisco,活化酶做深入的研究。,三、研究内容,Rubisco,和,Rubisco,活化酶的提取和纯化,Rubisco,和,Rubisco,活化酶抗体的制备,Rubisco,和,Rubisco,活化酶,ELISA,标准曲线的制定,C3,、,C4,植物中,Rubisco,和,Rubisco,活化酶含量比较及其与光合作用的关系,光暗处理对小麦光合作用及,Rubisco,、,Rubisco,活化酶的影响,施氮处理对小麦光合速率和,Rubisco,、,Rubisco,活化酶的影响,Rubisco,和,Rubisco,活化酶单克隆抗体制备初探,试验设计流程,Rubisco,和,Rubisco,活化酶的分离提纯,Rubisco,和,Rubisco,活化酶抗体的制备,抗体的分离与纯化,利用抗体定量测定不同处理下,Rubisco,及,Rubisco,活化酶的含量,四、材料、仪器和方法,1,、材料与仪器,1.1,材料,植物材料,扬麦,5,号,动物材料 新西兰大白兔,1.2,试剂与仪器,高速冷冻离心机,液相层析收集系统,垂直板电泳系统,Beckman LS-9800,液体闪烁仪,酶联免疫测定仪,2,、酶,的,提取和纯化,3.1,免疫过程,:,以皮内多位点分数次注射法进行免疫,首次免疫,加强免疫,二次免疫,0.5ml,抗原,+0.5ml,佐剂,皮内注射于兔子背部多个部位,三周后，,0.5ml,抗原,+0.5ml,佐剂,皮下注射于兔子背部多个部位,三周后，静脉注射,0.5ml,抗原,检测效价,一周后，耳缘静脉采血，检测抗体效价,3,、,Rubisco,及,Rubisco,活化酶抗体的制备,3.2,采血,用心脏取血的方法采血,3.3,分离血清,4,下离心,30min,，,除去红细胞，获得血清；或者将血液收聚在培养皿中，,37,放置,6h,，,用吸管吸取析出的血清。将血清分装于灭菌瓶，储存于零下,20,，或加,0.1%NaN3,或,0.01%,硫柳汞后，储存于,4,冰箱中。,4,、,ELISA,法测定酶含量,Rubisco,和,Rubisco,活化酶的定量测定,用一系列已知浓度的标准抗原（,Rubisco,和,Rubisco,活化酶）与制备的,Rubisco,和,Rubisco,活化酶的抗体反应，制成一条标准曲线，再将待测样品与之相比较，求得样品中抗原的含量,Rubisco,含量（,mgg,-1,FW,）,=,提取液（,mL,）,+,鲜叶重（,g,）,稀释倍数,由标准曲线计算的,Rubisco,浓度,/,叶片鲜重,5,、蛋白质含量的测定,依,Folin,-,酚试剂法（薛应龙，,1985,）测定，以,BSA,作标准曲线,6,、光合速率和叶绿素含量的测定,光合速率用便携式光合速率测定仪测定,叶绿素含量用分光光度计测定,五、实验进展,1,、,Rubisco,的提纯和纯度鉴定,Rubisco,的电泳图谱,A,为,Rubisco,的,ND-PAGE,图谱,B,为,Rubisco,的,SDS-PAGE,图谱,55 000,14 800,2,、小麦,Rubisco,活化酶的的提纯和纯度鉴定,Rubisco,活化酶的,SDS-PAGE,图谱,A,为,Rubisco,活化酶,;B,为标准蛋白,45 000,41 000,六、研究计划,1,、,Rubisco,和,Rubisco,活化酶抗体的制备,2,、,Rubisco,和,Rubisco,活化酶,ELISA,标准曲线的制定,3,、,C3,、,C4,植物中,Rubisco,和,Rubisco,活化酶含量比较及其与光合作用的关系,4,、光暗处理对小麦光合作用及,Rubisco,、,Rubisco,活化酶的影响,5,、不同施氮水平对小麦光合速率和,Rubisco,、,Rubisco,活化酶的影响,6,、,Rubisco,和,Rubisco,活化酶单克隆抗体制备初探,谢谢！,谢谢！,