课题3　血红蛋白的提取和分离 (2)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,课题,3,血红蛋白的提取和分离,一、基础知识,：,（一）,蛋白质提取和分离原理,（二）蛋白质提取和分离的方法,1,）凝胶色谱法：又称分配色谱法,2,）电泳法,（三）缓冲液的作用,二、实验操作实验步骤,样品处理,和粗分离,纯 化,纯度鉴定,血液组成成分,1.,洗 涤,红 细 胞,2.,释放,血红蛋白,3.,分离,血红蛋白,4.,透析,血红蛋白,二、实验操作实验步骤,血液组成成分,1.,洗 涤,红 细 胞,2.,释放,血红蛋白,3.,分离,血红蛋白,4.,透析,血红蛋白,样品处理,和粗分离,纯 化,纯度鉴定,蛋白质提取与分离的依据,蛋白质的物理化学性质差异：,1.,分子的形状、大小,2.,电荷性质和多少,3.,溶解度,4.,吸附性质,5.,对其他分子亲和力,1.,凝胶色谱法,（,1,）原理：,（,2,）材料：凝胶,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；,小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,凝胶是,微小的多孔性球体,，如,葡聚糖或琼脂糖,。内部有许多贯穿的,通道,.,根据相对,分子质量的大小,分离蛋白质的方法,概念：,3.,原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在,凝胶外部,移动,路程,较长,移动速度,较慢,路程,较短,移动速度,较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，,促使蛋白质分子的差速流动。,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,直径大小,运动,方式,运动,速度,运动,路程,洗脱,次序,相对分子质量大,相对分子质量小,较大,较小,垂直向下的运动,无规则的扩散运动,较快,较慢,较短,先流出,较长,后流出,2,凝胶电泳法：,1,）原理：,不同蛋白质的,带电性质,（正电荷或负电荷）,、电量、形状和大小,不同，在电场中受到的作用力,大小、方向、阻力,不同，导致不同蛋白质在电场中的,运动方向,和,运动速度,不同。,2）,影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考,：,蛋白质为什么带有电荷？,在一定的PH下,，蛋白质可解离的基团会带上电荷,2,凝胶电泳法：,1,）原理：,不同蛋白质的,带电性质,（正电荷或负电荷）,、电量、形状和大小,不同，在电场中受到的作用力,大小、方向、阻力,不同，导致不同蛋白质在电场中的,运动方向,和,运动速度,不同。,2）,影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考,：,蛋白质为什么带有电荷？,3）,常用电泳方法,琼脂糖凝胶电泳,聚丙酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,加入带负电荷多的,SDS,，形成,“,蛋白质,SDS,复合物,”,，使蛋白质,迁移速率仅取决于分子大小,。,影响蛋白质分子运动速度的因素,决定,运动方向,电场,作用,力,形成,阻力,决定,运动速率,电荷性质,电荷量,分子形状,分子大小,由,弱酸,和相应的,强碱弱酸盐,溶解于,水,中。,如,H,2,CO,3,/NaHCO,3,，,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,等,（,4,）,缓冲溶液洗脱剂,作用：,配制：,调节酸和盐的用量，可配制不同,pH,的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液,pH,的干扰而保持,pH,稳定。,思考：如何配制不同,PH,值不同的缓冲液？,血液组成成分,阅读思考：,血液由,_,和,_,两部分组成。,血细胞中,_,细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是,_,。,该化合物是由,_,和,_,构成的，其中每个亚基中都含有一个能与,O,2,和,CO,2,结合的,_,基团。,血浆,血细胞,红细胞,血红蛋白,2,条,-,肽链,2,条,-,肽链,亚铁血红素,1.,洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的,目的,是什么？洗涤的,方法,是什么？,洗涤干净,的标志是什么？,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,重复洗涤,3,次，,直至上清液没有黄色,2.,释放血红蛋白,阅读思考：,释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？,为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：,蒸馏水,的作用是,_,。,加入,甲苯,的作用是,_,。,充分搅拌的目的是,_,。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,滤纸,过滤,脂类物质,3.,分离血红蛋白,分离过程,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,烧杯,有机溶剂,血红蛋白,20mmol/L,磷酸缓冲液,4.,透析血红蛋白,透析的目的是什么？,1mL,1mL,1mL,去除血红蛋白中的小分子杂质,纯化,凝胶色谱操作,1.,凝胶色谱柱的制作：,2.,凝胶色谱柱的装填：,教材图,5,19,3.,样品的加入和洗脱,2.,凝胶色谱操作,:,（,1,）凝胶色谱柱的制作：,取长,40,厘米，内径,1.6,厘米的玻璃管，,两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：,打孔,挖出凹穴,安装移液管头部,覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端,。,注意事项,：,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞的制作：,打孔,安装玻璃管,。,组装：,将上述三者按相应位置组装成一个整体,。,安装其他附属结构。,（,2,）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：,A,、材料：,交联葡聚糖凝胶（,G-75,）。,B,、代表意义：,“,G,”,表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,。,75,表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水,7.5,克。,凝胶的前处理：,配置凝胶悬浮液：,计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填方法：,A,、固定：,将色谱柱装置固定在支架上。,B,、装填：,将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,注意：,1,、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。,2,、装填凝胶柱时不得有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,。,步骤,操作要求,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡,12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：,交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液,“,G,”,表示什么？,75,代表什么？,注意,：,色谱柱不能内不能有,气泡,；,装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝 胶是凝胶,装填紧密,装配好的凝胶柱,（,3,）样品加入与洗脱,注意：,正确的加样操作是：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样。,3,、使吸管管口沿管壁环绕移动。,开始进行层析,3.,样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样,3.再调液面,4.洗脱,5.收集,缓冲液,凝胶,收集得到的纯化后的蛋白,注意事项,1.,红细胞的洗涤：,洗涤次数不能过少；低速、短时离心。,2.色谱柱的装填：,装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流,。,3,.,凝胶的预处理,：,沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡,4.,色谱柱成功标志：,红色区带均匀一致地移动,。,Why？,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,透析过程动画演示,采集得到鸡血,柜式离心机,初次离心后的结果,3,次洗涤后的结果,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,知识总结,血红蛋白的提取和分离,蛋白质分子的差异性,凝胶色谱法,原 理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组 成,作 用,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度鉴定,