米氏常数测定课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验十六,底物浓度对酶促反应速度的影响,米氏常数的测定,目的要求,（,1,）,了解底物浓度对酶促反应的影响。,（2）,掌握测定米氏常数,Km,的原理和方法,实验原理,Km,定义：,Km,值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时,所对应的底物浓度。,Km,的意义,Km,是酶的特性常数之一，不同的酶,Km,值不同，同,一种酶与不同底物反应,Km,值也不同。,Km,值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：,Km,值大，表明亲和力小；,Km,值小，表明亲和力大。,测定,Km,值是酶学研究的一个重要方法。,米氏方程：,VS,v=Km+S,v :,反应初速度 （微摩尔浓度变化/,min),V:,最大反应速度（微摩尔浓度变化/,min),S：,底物浓度 （,mol/L),Km:,米氏常数 （,mol/L),此方程表明，当已知,Km,及,V,时，酶反应速度与底物浓度 之间的定量关系。,双倒数作图法测定,Km,值：,1,Km 1 1,v V S V,胰蛋白酶的性质,胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（,L-,精氨酸和,L-,赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解，产生自由氨基端。,氨基的测定,甲醛滴定法,CH,2,NH,2,HCHO,COO,-,CH,2,NHCH,2,OH,HCHO,COO,-,CH,2,NH(CH,2,OH),2,COO,-,试剂和器材,1.10,40,g/L,酪蛋白溶液（,pH8.5,）：,四种不同,S,的酪蛋白标准溶液。,2.,中性甲醛溶液：,75,mL,分析纯甲,醛加,15,mL 0.25%,酚酞乙醇溶液，,以,0.1,M NaOH,滴至微红，密闭于,玻璃瓶中。,（自己配制）,3.0.25%,酚酞乙醇溶液：,4.标准,0.1,M NaOH,溶液。,5.胰蛋白酶溶液,（已配好）,试剂,器材,：,碱式滴定管,1,取,50,mL,三角瓶,4,个，加入,5,mL,甲醛与,1,滴酚酞，以,0.1,M,标准,NaOH,滴定至微红色，,4,个瓶颜色应当一致，编号。,2,量取,40,g/L,酪蛋白,50,mL,，,加入一,150,mL,三角瓶，,37,保温,10,分钟，同时胰蛋白酶液也在,37,保温,10,分钟，然后吸取,5,mL,酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出,10,mL,反应液（定为,0,时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（,1,号）加,10,滴酚酞；以,0.1,M NaOH,滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的,NaOHmL,数，每,mL,加一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的,0.1,M,标准,NaOH mL,数。,操作方法,3在2分钟、4分钟、6分钟时，分别取出10,mL,反应,液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上操作，记下耗,去,NaOH mL,数。,以滴定度（即耗去的,NaOH mL,数）对时间作图，,得一直线，其斜率即初速度为,V,40,（,相对于40,g/L,的酪蛋白浓度）。,然后分别量取30,g/L、20g/L、10g/L,的酪蛋白溶,液，重复上述操作，分别测出,V,30,、V,20,、V,10,。,利用上述结果，以1/,v,对1/,s,作图，即求出,V,与,K,m,值。,（,1,）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定,pH,及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。,（,2,）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。,注意事项,思考题,试述底物浓度对酶促反应速度的影响。,试述在何种条件下，测定酶的,Km,值可以作为鉴定酶的一种手段。,米氏方程中的,Km,值的实际应用是什么？,本实验中的注意事项是什么？,