NK细胞杀伤活性检测-2013-7-5兼

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,NK细胞杀伤活性检测-乳酸脱氢酶释放法,2013-7-5,目的要求,熟悉乳酸脱氢酶释放法测定,NK,细胞杀伤活性的检测方法。,【,原理,】,乳酸脱氢酶,(LDH),是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，,LDH,不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，,LDH,可释放至介质中。释放出来的,LDH,在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使,氧化型辅酶,(NAD+),变成,还原型辅酶,(NADH2),。后者再通过递氢体,-,吩嗪二甲酯硫酸盐,(PMS),还原硝基氯化四氮唑蓝,(NBT),，形成,有色,的甲臢类化合物，在,490nm,或,570nm,波长处有一高吸收峰。利用读取的,A,值，经过计算即可得知,NK,细胞杀伤靶细胞的活性。,实验原理,效应细胞 靶细胞 释放,LDH,丙酮酸,乳酸,乳酸脱氢酶,(LDH),NAD,+,NADH+H,+,PMS,NBT,甲臢,(OD570nm,）,吩嗪二甲酯硫酸盐,硝基氯化四氮唑蓝,【,试剂,】,1,.,靶细胞,检测人的,NK,细胞活性常用的靶细胞为体,外传代细胞株,K562,。,2.,效应细胞,从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核,细胞。,3.1640,培养液,4.LDH,底物溶液（临用前配制）,NBT,硝基氯化四氮唑蓝,4mg,NAD+I,氧化型辅酶,I 10mg,PMS,吩嗪二甲酯硫酸盐,1mg,【,试剂,】,加蒸馏水,2ml,溶解，混匀后取上清液,1.6ml,，加,1mol/L,乳酸钠,0.4ml,，然后加入,0.1mol/L pH7.4 PBS,至,10ml,。,5.,1%NP,40,：,取,1ml NP-40,加去离子水,99ml,。,6.,1mol/L,柠檬酸终止液,取柠檬酸,21g,加去离子水,100ml,实验步骤,效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）,靶细胞的制备,效,-,靶细胞相互作用,酶促反应,结果判读,取培养,2448hr,的靶细胞,(K562),洗涤,3,次（,1000rpm10min,）,最后用完全,RPMI-1640,培养液调整细胞浓度至,110,5,/ml,备用。,靶细胞的制备：,效应细胞的制备,（分离外周血单个核细胞）,采集静脉血,4 ml,，加,0.2ml,肝素溶液（,125-250U/ml,）抗凝,分别吸取,2ml,淋巴细胞分层液置,10ml,离心管中，,将管倾斜,45,，沿管壁缓缓注入抗凝血,离心,2000rpm20min,密度梯度离心分离淋巴细胞亚群,用完全,RPMI-1640,定容细胞，计数后调整细胞浓度,（加入,0.2ml,完全,RPMI-1640,，混匀，,1x 10,7,）,将所得,PBMC,用,5,倍体积的,1640,洗涤一次,2000rpm10 min,用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，,再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）,计数,PBMC,1.,计数,4,个大方格中（即,64,个小方格）所有细胞数,2.,计数原则：数上不数下，数左不数右。,3.,总数除以,4,，所得数据,10,4,即为,1ml,液体中的细胞总数,4.,每,ml,健康成人血可分离出,110,6,210,6,个单个核细胞,计数,PBMC,举例,数,4,个大方格细胞数分别为：,87,，,79,，,91,，,85,总数为：,87+79+91+85=342,一个大方格的平均数为：,342/4=85.5,1ml,液体中细胞量为：,85.510,4,如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的,2,倍。,效,-,靶细胞作用,将效应细胞和靶细胞各,0.1ml(E/T=100:1),加入,96,孔细胞培养板的孔中,每份标本设,2,个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组,(0.1ml,靶细胞,+0.1ml RPMI-1640,液,),最大释放对照组,(0.1ml,靶细胞,+0.1ml1,NP-40,液,),1000r/min,2min,后,置,37,、,5,CO,2,温箱中孵育,2-4h,。,A,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,实验组 自然释放组 最大释放组,1 2 3 4 5 6,效应细胞（,100l,）,+,-,靶细胞（,100l,）,+,RPMI1640,（,100l,）,-,+,-,1%NP-40,（,100l,）,-,+,【,操作方法,】,酶促反应：从,37,温箱中取出培养物，吸取各孔上清,0.1ml,加于另一培养板孔中。,酶促反应,置,37,预温,10min,加入新鲜配制的底物溶液,0.1ml,37,避光反应,10,15min,。,终止酶促反应,（用毛细吸管滴一滴,1mol/L,柠檬酸,30l,）,A,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,结果计算,用酶标检测仪在,570nm,波长下读取各孔,OD,值,并计算,NK,细胞活性。,实验组,OD,值,-,自然释放对照组,OD,值,NK,细胞活性（,%,）,最大释放对照组,OD,值,-,自然释放对照组,OD,值,=,100%,1,、无论采用何种试验方法,靶细胞的质量是影响细,胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因,素。一般要求靶细胞的自然释放率,10,。,2,、分离,PBMC,时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白,层，切勿搅动各层。,3,、吸取细胞培养上清时,应尽可能不吸动沉淀的细,胞。,4,、用此法测得,NK,活性的正常值范围在,10-40%,。,注意事项,:,实验报告,记录,NK,细胞杀伤实验的原理、方法、,结果。,T,淋巴细胞检查,1,T,细胞检查,（1）,T,细胞花环形成试验,（,Erythrocyte rosette formation test,ERFT,）,E,花环形成试验,（,Erythrocyte rosette formation test,ERFT,）,【目的要求】,1.掌握,T,淋巴细胞,E,花环试验的原理、正常值，,了解其方法和用途。,2.熟悉光镜下,E,花环的形态和计数方法。,【实验原理】,T,细胞表面具有能与绵羊红细胞（,SRBC,）,表面糖肽结合的受体，称为,E,受体,（,CD2,）。,已证实,E,受体是人类,T,细胞所特有的表面标志。当,T,细胞与,SRBC,混合后，,SRBC,便粘附于,T,细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查,T,细胞的方法，称为,E,花环形成试验,。,根据花环形成的多少，可测知,T,细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。,【实验方法】,淋巴细胞与,SRBC,按一定比例(1:10)混合,37,5,分钟，4,20,分钟,取样涂片,瑞氏,染色、镜检。,计数,E,花环数，算出总花环形成率。,正常值为60%80%。,【结果观察】,高倍镜检查：淋巴细胞呈蓝色，,SRBC,呈红色围绕淋巴细胞形成花环，凡表面粘附有3个或3个以上,SRBC,者为花环形成细胞（即,E,阳性细胞）。,计数200个淋巴细胞，算出花环形成百分率，并推测其,T,淋巴细胞百分率。正常值为：5080%。,花环形成百分率%=,花环形成细胞,花环形成细胞+,不形成花环细胞,100%,花环形成细胞,