生物化学仪器分析-紫外ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,下午1时22分,#,北京理工大学生命科学与技术学院 本科生课程,生化仪器分析,4:08 下午,1,第,3,章 紫外光谱,Ultraviolet Spectrometry, UV,主讲：孙立权,6:08 上午1第3章 紫外光谱主讲：孙立权,05 十一月 2024,2,07 十月 20232,05 十一月 2024,3,3.1,紫外吸收光谱分析基本原理,Principles of UV,3.1.1,紫外吸收光谱的产生,3.1.2,有机物紫外吸收光谱,3.1.3,有机物紫外吸收光谱,3.1.4,蛋白紫外吸收光谱,3.1.5,核酸紫外吸收光谱,3.1.6,紫外吸收光谱影响因素,3.1.7,显色反应,07 十月 202333.1 紫外吸收光谱分析基本原理,05 十一月 2024,4,3.1,紫外吸收光谱分析基本原理,Principles of UV,3.1.1,紫外吸收光谱的产生,Formation of UV,1.,概述,基于物质对紫外光选择性吸收的分析方法。,250 300 350 400nm,1,2,3,4,e,07 十月 202343.1 紫外吸收光谱分析基本原理Pr,05 十一月 2024,5,2.,物质对光的选择性吸收及吸收曲线,M +,热,M +,荧光或磷光,E,=,E,2,-,E,1,=,h,量子化 ；选择性吸收,定性依据。,M +,h,M,*,基态 激发态,E,1,（,E,）,E,2,07 十月 202352.物质对光的选择性吸收及吸收曲线M,05 十一月 2024,6,可见,紫外波长范围：,100-800 nm.,(1),远紫外光区,:,100-200nm,(2),近紫外光区,:,200-400nm,(3),可见光区,:,400-800nm,3.1.1,紫外吸收光谱的产生,Formation of UV,07 十月 20236可见紫外波长范围：100-800 n,05 十一月 2024,7,可见光谱与紫外光谱的共同之处,光谱法：可用于结构鉴定、定性和定量分析；,定性依据：特征吸收；,定量依据：朗伯,比耳定律；,能级跃迁：分子中价电子能级跃迁；,光谱形状：电子跃迁的同时，伴随着振动、转动能级的跃迁,带状光谱,。,3.1.1,紫外吸收光谱的产生,Formation of UV,07 十月 20237可见光谱与紫外光谱的共同之处3.1.1,05 十一月 2024,8,可见光谱与紫外光谱的共同之处,吸收曲线（,A-,曲线）,吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,关于吸收曲线的讨论与可见光谱相同,3.1.1,紫外吸收光谱的产生,Formation of UV,07 十月 20238可见光谱与紫外光谱的共同之处3.1.1,05 十一月 2024,9,3.电子跃迁与分子吸收光谱,物质分子内部三种运动形式：,（,1,）电子相对于原子核的运动；,（,2,）原子核在其平衡位置附近的相对振动；,（,3,）分子本身绕其重心的转动。,3.1.1,紫外吸收光谱的产生,Formation of UV,07 十月 202393.电子跃迁与分子吸收光谱3.1.1,05 十一月 2024,10,分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级,三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。,分子的内能：电子能量,Ee,、振动能量,Ev,、转动能量,Er,即,e+,v+,r,evr,3.电子跃迁与分子吸收光谱,07 十月 202310分子具有三种不同能级：电子能级、振动,05 十一月 2024,11,能级跃迁,电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现,宽谱带,。,3.电子跃迁与分子吸收光谱,07 十月 202311能级跃迁3.电子跃迁与分子吸收光谱,05 十一月 2024,12,讨 论,转动能级间的能量差,r,：,0.005,0.050eV,，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；,振动能级的能量差,v,约为：,0.05,eV,，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；,电子能级的能量差,e,较大,1,20eV,。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外,可见光区，紫外,可见光谱或分子的电子光谱。,07 十月 202312讨 论转动能级间的能量差r,05 十一月 2024,13,讨 论,吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。,吸收谱带的强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数,max,也作为定性的依据。不同物质的,max,有时可能相同，但,max,不一定相同；,吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。,07 十月 202313讨 论吸收光谱的波长分布是由产,05 十一月 2024,14,1,有机化合物电子类型及电子跃迁类型,三种价电子：,电子、,电子、,n/p,电子,；,电子跃迁类型：,n,；,；,n,；,。,s,p,*,s,*,R,K,E,B,n,p,E,C,O,H,n,p,s,H,3.1.2,有机物紫外吸收光谱,Ultraviolet spectrometry of organic compounds,07 十月 2023141有机化合物电子类型及电子跃迁类型,05 十一月 2024,15,分子轨道理论：成键轨道,反键轨道。,当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态,(,反键轨道,),跃迁。,主要有四种跃迁，所需能量,大小顺序为：,n, , n, ,3.1.2,有机物紫外吸收光谱,Ultraviolet spectrometry of organic compounds,07 十月 202315分子轨道理论：成键轨道反键轨道。,05 十一月 2024,16,2,跃迁,所需能量最大；,电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁；,饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；,吸收波长,200 nm,；,例：甲烷的,max,为,125nm ,乙烷,max,为,135nm,。,只能被真空紫外分光光度计检测到；,作为,溶剂,使用。,07 十月 2023162跃迁所需能量最大；电子,05 十一月 2024,17,3n,跃迁,所需能量较大。,吸收波长为,150,250nm,，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。,末端吸收。,含非键电子的饱和烃衍生物,(,含,N,、,O,、,S,和卤素等杂原子,),均呈现,n,跃迁。,07 十月 2023173n 跃迁所需能量较大。,05 十一月 2024,18,4,跃迁,所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，,max,一般在,10,4,Lmol,1,cm,1,以上，属于强吸收。,（,1,） 不饱和烃,*,跃迁,乙烯,*,跃迁的,max,为,165nm,max,为,: 110,4,Lmol,-1,cm,-1,。,K,带,共轭非封闭体系的,*,跃迁,C=C,发色基团， 但,*,200nm,。,max,=165nm,助色基团取代,*,(,K,带,),发生红移,07 十月 2023184 跃迁所需能量较小，吸收波,165,nm,217,nm,(,HOMO LVMO),max,（,2,）共轭烯烃中的,*,165nm 217nm ,05 十一月 2024,20,5,n,跃迁,含杂原子的双键化合物，或者当有杂原子上的孤对电子与碳原子上的,*,轨道，则可产生,n,*,跃迁吸收。,200,400nm,。,禁阻跃迁，吸收强度很弱,，,200nm,的光,),，但当它们与生色团相连时，就会,发生,n,共轭,作用，增强生色团的生色能力,(,吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加,),，这样的基团称为助色团。,(auxochrome),07 十月 2023236. 生色团与助色团助色团：一些含有,05 十一月 2024,24,7.,红移与蓝移,红移,:,max,向长波方向移动。,蓝移,(,或紫移,):,max,向短波方向移动。,增色效应或减色效应,:,吸收强度即摩尔吸光系数,增大或减小的现象分别称为,。,有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长,max,和吸收强度发生变化。,07 十月 2023247. 红移与蓝移红移:max向长波,9.,有,机化合物的吸收带,吸收带(,absorption band):,在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。,R,吸收带,K,吸收带,B,吸收带,E,吸收带,9. 有机化合物的吸收带吸收带(absorption ban,05 十一月 2024,26,吸收带及吸收带类型,吸收峰对应的波长位置称为吸收带。,R,吸收带：,由于发生,n,跃迁而产生的吸收带。,n,为禁阻跃迁，跃迁几率很小；,一般地，,R,吸收带的,270nm,，,100,；,当使用极性溶剂时，,R,吸收带,发生蓝移。,07 十月 202326吸收带及吸收带类型吸收峰对应的波长位,05 十一月 2024,27,吸收带及吸收带类型,K,吸收带：,由,*,跃迁而产生的吸收带。,发生在共轭烯炔分子；,吸收很强，,10,4,；,波长位置小于,R,吸收带。,1：,乙醚,2：,水,1,2,250,300,苯酰丙酮,非极性,极性,n,*,跃迁：,兰移；,；,*,跃迁：,红移；,；,07 十月 202327吸收带及吸收带类型K吸收带：由,05 十一月 2024,28,吸收带及吸收带类型,B,吸收带：,位于,278nm,的吸收带。,由苯环的,*,跃迁引起；,吸收较强，,=1100,；,在非极性溶剂中测定时有精细结构，而在极性溶剂中精细结构消失。,当芳环与发色团直接相连时会同时出现,K,、,B,两带,(,B,带波长较长,),，且,B,带产生红移。若分子中含有,n,电子，还会有,R,带同时出现。,07 十月 202328吸收带及吸收带类型B吸收带：位于27,05 十一月 2024,29,吸收带及吸收带类型,E,吸收带：,在一定意义上，苯环可看成三个共轭的乙烯组成。,苯环中的这种乙烯键和共轭乙烯键引起的紫外吸收带分别称为,E,1,和,E,2,带。,四种吸收带按能量高低排列：一般有,E,1,E,2,K,B,R,07 十月 202329吸收带及吸收带类型E吸收带：在一定意,05 十一月 2024,30,10.,吸收波长的计算,非共轭体系：,饱和烷烃；有助色团取代的衍生物；孤立发色团。,共轭体系：,共轭烯烃。,07 十月 20233010. 吸收波长的计算非共轭体系：,165,nm,217,nm,(,HOMO LVMO),max,基,-,是由非环或六环共轭二烯母体决定的基准值；,无环、非稠环二烯母体：,max,=217 nm,共轭烯烃（不多于四个双键）,*,跃迁吸收峰位置可由,伍德沃德,菲泽,规则估算。,max,=,基,+,n,i,i,a,.,共轭烯烃中的,*,165nm 217nm ,异环（稠环）二烯母体：,max=217 nm,同环（非稠环或稠环）二烯母体：,max=253 nm,n,i,I,:,由双键上取代基种类和个数决定的校正项,(1),每增加一个共轭双键,+30,(2),环外双键,+5,(3),双键上取代基：,酰基（,-OCOR,）,0,卤素（,-Cl,，,-Br,）,+5,烷基（,-R,）,+5,烷氧基（,-OR,）,+6,异环（稠环）二烯母体： (1)每增加一个共轭双键 +30酰,05 十一月 2024,33,217,227,07 十月 202333217227,05 十一月 2024,34,07 十月 202334,05 十一月 2024,35,b.,羰基化合物共轭烯烃中的,*,Y=,H,R,n ,*,180-190nm,*,150-160,nm,n ,*,275-295nm,Y=,-NH2,-OH,-OR,等助色基团,K,带红移，,R,带兰移；,R,带,max,=205nm,；,10-100,K,K,R,R,n,n,165,nm,n,不饱和醛酮,K,带红移：,165,250nm,R,带红移：,290,310nm,07 十月 202335b.羰基化合物共轭烯烃中的 ,05 十一月 2024,36,c,., -,不饱和羧酸及其酯,*,跃迁,K,带红移程度小于,-,不饱和酮, ,max,约,200240nm,，,10,4,。,由于存在这种共轭，羰基的亲电子性降低，即接受,C=C,上,电子，形成,*,跃迁的能力降低，使,-,不饱和酸及酯发生,*,跃迁需要较大的能量，,max,蓝移。,07 十月 202336c. , -不饱和羧酸及其酯,05 十一月 2024,37,d.,芳香烃及其杂环化合物,苯：,E,1,带,180,184nm,；,=,47000,E,2,带,200,204 nm,=,7000,苯环上三个共轭双键的,*,跃迁特征吸收带；,B,带,230-270 nm,=,200,*与,苯环振动引起；,含取代基时，,B,带简化，红移。,max,（,nm,）,max,苯,254,200,甲苯,261,300,间二甲苯,263,300,1，3，5-,三甲苯,266,305,六甲苯,272,300,07 十月 202337d. 芳香烃及其杂环化合物 苯：,05 十一月 2024,38,乙酰苯紫外光谱图,羰基双键与苯环共轭：,K,带强；苯的,E,2,带与,K,带合并，红移；,取代基使,B,带简化；,氧上的孤对电子：,R,带，跃迁禁阻，弱；,C,C,H,3,O,n,*,;,R,带,*,;,K,带,07 十月 202338乙酰苯紫外光谱图羰基双键与苯环共轭：,05 十一月 2024,39,苯环上助色基团对吸收带的影响,07 十月 202339苯环上助色基团对吸收带的影响,05 十一月 2024,40,苯环上发色基团对吸收带的影响,07 十月 202340苯环上发色基团对吸收带的影响,.,立体结构和互变结构的影响,顺反异构,：,顺式：,max,=280nm,；,max,=10500,反式：,max,=295.5 nm,；,max,=29000,互变异构,：,酮 式：,max,=204 nm,烯醇式：,max,=243 nm,. 立体结构和互变结构的影响顺反异构：互变异构：,05 十一月 2024,42,立体结构和互变结构的影响,07 十月 202342立体结构和互变结构的影响,.,溶剂的影响,1：,乙醚,2：,水,1,2,250,300,苯酰丙酮,非极性,极性,n,*,跃迁：,兰移；,；,*,跃迁：,红移；,；,极性溶剂使精细结构消失,. 溶剂的影响1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮 非极性,.,溶剂的影响,非极性 极性,n,n,p,n,p,n,*,跃迁：,兰移；, ；,*,跃迁：,红移；,；,max,(,正己烷,),max,(,氯仿,),max,(,甲醇,),max,(,水,),230,238,237,243,n,329,315,309,305,. 溶剂的影响非极性 极性 n n ,05 十一月 2024,45,3.1.3,无机化合物紫外可见吸收光谱,1.,电荷迁移跃迁,(1),配合物的电荷迁移跃迁,配合物分子吸收光辐射后，分子中的电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上，或按相反方向转移，产生电荷迁移跃迁吸收光谱。这种电荷迁移光谱通常发生在具有,d,电子的过渡金属离子和有丌键的共轭体系的有机配位化合物及许多水合无机离子中。这种配合物电荷迁移跃迁可表达为：,无机配位化合物紫外,-,可见吸收光谱的电子跃迁形式主要有电荷迁移跃迁和配位场跃迁 两种形式。,M,n+,L,b-,M,(n-1) +,L,(b-1) -,h,07 十月 2023453.1.3 无机化合物紫外可见吸,16:08:48,(2),过渡金属离子与生色团试剂生成配合物的电荷迁移跃迁如,Fe(),与,CNS,离子配位。,Fe,3+,CNS,-,2+,h,Fe,2+,CNS,2+,电子给予体,电子接受体,分子内氧化还原反应,；,10,4,Fe,2+,与邻菲罗啉配合物的紫外吸收光谱属于此。,06:08:49(2)过渡金属离子与生色团试剂生成配合物的电,电荷迁移吸收光谱的波长取决于电子给予体和电子接受体相应轨道的,能量差,。如金属离子的氧化性强，而配位体,L,的还原性强，则发生电荷迁移所需的能量较小，则吸收光波长会发生红移,电荷迁移跃迁吸收光谱的谱带较宽，并易受环境因素的影响，用其波谱定性及结构分析比较困难。但电荷迁移吸收光谱最大的特点是摩尔吸收系数很大，一般在,10,4,10,7,。因此，用这类吸收谱带进行定量分析时，可以显著提高检测的灵敏度。相反，则吸收光波长会发生紫移。,电荷迁移吸收光谱的波长取决于电子给予体和电子接受体相应轨道,16:08:48,2,. 配位场跃迁,（,1,）配体微扰的金属离子,d,-,d,电子跃迁和,f,-,f,电子跃迁,在配体的作用下过渡金属离子的,d,轨道和镧系、锕系的,f,轨道裂分，吸收辐射后，产生,d,一,d、 f,一,f,跃迁；,必须在配体的配位场作用下才可能产生也称配位场跃迁；,（,2,）金属离子微扰的配位体内电子跃迁,金属离子的微扰，将引起配位体吸收波长和强度的变化。变化与成键性质有关，若共价键和配位键结合，则变化非常明显。,摩尔吸收系数,很小，对定量分析意义不大，但可用于研究配合物的结构，为现代无机配合物键合理论的建立、金属酶和生物无机化学等提供非常有用的信息。,06:08:49 2. 配位场跃迁,05 十一月 2024,49,3.1.4,蛋白质紫外吸收光谱,蛋白质具有很强的紫外吸收，通常情况下一般蛋白质在紫外区的最大峰在,280nm,左右,(,见图,2,8),。,07 十月 2023493.1.4 蛋白质紫外吸收光谱,05 十一月 2024,50,3.1.4,蛋白质紫外吸收光谱,利用蛋白质的这一特性，能够设计多种蛋白质,定量分析,的方法。同时，蛋白质的最大吸收峰不同于核酸的,260nm,最大吸收峰。,基于这种差异，仍然能够利用紫外吸收对含有,DNA,的蛋白质样品进行定量分析。,在小于,240nm,波长的紫外区有很强的光吸收效应，但较难利用这一特性。,这是因为，在这一紫外区，很多缓冲液具有很强的紫外吸收，并且缓冲液一般浓度很高，这会严重干扰蛋白质的定量分析。但如果背景缓冲液不具有紫外吸收的特性，则可以充分利用蛋白质在,200,220nm,的强紫外吸收性质,。,07 十月 2023503.1.4 蛋白质紫外吸收光谱,05 十一月 2024,51,3.1.4,蛋白质紫外吸收光谱,蛋白质的紫外吸收特性主要是由蛋白质所含的,酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,等引起。,由于苯环,(,包括共轭双键等,),的存在，这几种氨基酸在,240,300nm,的紫外区内均具有强力的光吸收特性；虽然其他氨基酸也具有紫外吸收的性质，但在此紫外区内一般很弱，对蛋白质的紫外吸收贡献不大。,07 十月 2023513.1.4 蛋白质紫外吸收光谱,05 十一月 2024,52,3.1.4,蛋白质紫外吸收光谱,蛋白质的紫外吸收受多种因素的影响。,由于蛋白质分子为高分子聚合物，其构象受多种 因素,(,如溶液的,pH,、离子强度、金属离子、温度和变性剂等,),的影响；而蛋白质构象的变 化会改变具有紫外吸收的氨基酸在蛋白质表面的分布，进而影响蛋白质的紫外吸收光谱。特别值得注意的是，如蛋白质富含紫外吸收的氨基酸，其吸收系数会增加；相反，则降低。这 在蛋白质的定量分析时需要注意。,07 十月 2023523.1.4 蛋白质紫外吸收光谱,05 十一月 2024,53,3.1.5,核酸紫外吸收光谱,核苷、核苷酸、核酸的成分都有嘌呤和嘧啶碱基，这些碱基全含有共轭双键，使得这些碱基能强烈吸收,240,290nm,波段的紫外线，最大吸收在,260nm,左右。,因此核酸、核苷酸和核苷具有紫外吸收特性，,DNA,钠盐在,230nm,处为吸收低谷，但它的紫外吸收在,260nm,附近有最大吸收值，其吸光度,(absorbance),以,A260,表示，,A260,是核酸的重要性质,，在核酸的研究中很有用处。,RNA,钠盐的吸收曲线与,DNA,的无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。,07 十月 2023533.1.5 核酸紫外吸收光谱核,05 十一月 2024,54,3.1.5,核酸紫外吸收光谱,双链,DNA,和单链,DNA,的紫外光谱相似，摩尔吸收系数有大差。原因：双链中碱基被包裹在双链内部，弱；单链外露，强。,07 十月 2023543.1.5 核酸紫外吸收光谱双,温度对,DNA,的紫外吸收有明显的影响。在温度为,70C,以下，,DNA,以双链形式存在，因此紫外吸收相对较低。,在,70,85C,时，温度对,DNA,的紫外吸收具有显著的影响。,85C,以后，温度的增加对,DNA,紫外吸收的影响很弱，这是由于在,85C,以上，,DNA,以单链形式存在，紫外吸收接近最大值。,变性温度,(melting temperature,，,Tm),是指双链,DNA,分离成两个单链,DNA,时对应的温度。这一特性对,DNA,的分离分析非常重要。如,PCR,的设计就是基于,DNA,的变性温度的基础。,温度对DNA的紫外吸收有明显的影响。在温度为70C以下，,3.1.6,影响,UV,Vis,分析的因素,：,【1】,温度,【3】,溶液的浓度,【2】pH,的影响,【4】,光源狭缝的宽度,【5】,背景的吸收,3.1.6 影响UVVis分析的因素：【3】溶液的浓度【,1】,条件,化学反应，也就是显色反应,对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。,3.1.7,显色反应（条件和影响因素）,1】条件3.1.7 显色反应（条件和影响因素）,这些显色反应，必须满足以下条件：,【4】,.反应生成物的组成恒定。,【3】,. 反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变；,【2】,反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别；,【1】,反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；,这些显色反应，必须满足以下条件：【4】.反应生成物的组成恒定,影响显色反应的因素：,【1】,酸度,显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确定：测定某一固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标，溶液的,PH,值为横坐标作图。,【3】,.显色时间和温度,【2】,.显色剂的用量,影响显色反应的因素：【3】.显色时间和温度【2】.显色剂的用,测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度（吸光度为0）为100%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。,（,3,）、参比溶液的选择,测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶,参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：,1,】,溶剂参比 试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；,2,】,试样参比 如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。,参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：2】试样参比 如,3,】,试剂参比,如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。,4,】,. 平行操作参比 用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。,3】试剂参比 如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，,05 十一月 2024,63,3.2,紫外分光光度计,Ultraviolet spectrometer,一、基本组成,general process,二、分光光度计的类型,types of spectrometer,07 十月 2023633.2 紫外分光光度计Ultr,05 十一月 2024,64,一、基本组成,光源,单色器,样品室,检测器,显示,1.,光源,在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：,钨灯作为光源，其辐射波长范围在,320,2500 nm,。,紫外区：,氢、氘灯。发射,185,400 nm,的连续光谱。,07 十月 202364一、基本组成光源单色器样品室检测器显,05 十一月 2024,65,2,、单色器,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。,棱镜材料,石英,07 十月 2023652、单色器将光源发射的复合光分解成单,05 十一月 2024,66,3,、样品室,样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。,吸收池主要有,石英池,和玻璃池两种。,在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。,07 十月 2023663、样品室样品室放置各种类型的吸收池,05 十一月 2024,67,4,、检测器,利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号,常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,07 十月 2023674、检测器利用光电效应将透过吸收池的,05 十一月 2024,68,5,、结果显示记录系统,检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。,07 十月 2023685、结果显示记录系统检流计、数字显示,05 十一月 2024,69,二、紫外分光光度计的类型,1.,单光束：简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。,2.,双光束：自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,07 十月 202369二、紫外分光光度计的类型1.单光束：,05 十一月 2024,70,二、分光光度计的类型,3.,双波长：将不同波长的两束单色光,(,1,、,2,),快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。,无需参比池。,=1,2nm,。两波长同时扫描即可获得导数光谱。,07 十月 202370二、分光光度计的类型3.双波长：将不,05 十一月 2024,71,光路图,07 十月 202371光路图,05 十一月 2024,72,3.3,紫外吸收光谱的应用,Applications of UV,一、定性和定量分析,qualitative and quantitative analysis,二、有机物结构确定,structure determination of organic compounds,07 十月 2023723.3 紫外吸收光谱的应用,05 十一月 2024,73,一、定性、定量分析,1.,定性分析,max,：化合物特性参数，可作为定性依据；,有机化合物紫外吸收光谱：反映结构中生色团和助色团的特性，不完全反映分子特性；,计算吸收峰波长，确定共轭体系等,甲苯与乙苯：谱图基本相同；,结构确定的辅助工具；,max,，,max,都相同，可能是一个化合物；,标准谱图库：,46000,种化合物紫外光谱的标准谱图,The sadtler standard spectra ,Ultraviolet,07 十月 202373一、定性、定量分析1. 定性分析,05 十一月 2024,74,2.,纯度鉴定,依据：,max,； 峰形状和数量；,A,。,生物大分子紫外吸收特征。,核酸分子中含有碱基，,max,= 260nm,核酸典型吸收：,260nm,；纯核酸,A,280,/ A,260,=0.5,。,蛋白质分子中含有芳香族氨基酸，,max,= 280nm,蛋白质典型吸收：,280,nm,；纯蛋白,A,280,/ A,260,1.8,。,07 十月 2023742. 纯度鉴定依据： max ；,05 十一月 2024,75,3.,定量分析,依据：朗伯,-,比耳定律,吸光度：,A=, b c,；,透光度：,-,lgT = b c,。,灵敏度高：,max,：,10,4,10,5,L mol,-1, cm,-1,；,测量误差与吸光度读数有关：,A=0.434,，读数相对误差最小；,07 十月 2023753. 定量分析依据：朗伯-比耳定律,代入朗伯-比尔定律有：,c/c,=0.4343T/TlgT,要使测定的相对误差,c/c,最小，求导取极小得出：,lgT=-0.4343=A,即当,A=0.4343,时，吸光度测量误差最小。,最适宜的测量范围为0.20.8之间。,代入朗伯-比尔定律有：最适宜的测量范围为0.20.8之间。,测定方法,【1】,单组分定量方法,单组分是指样品溶液中含有一种组分，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。,其定量方法包括校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。,测定方法【1】 单组分定量方法 单组分是指样,1 校准曲线法,方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸光度，作,A-c,曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程。,在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。,1 校准曲线法方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的,【,2,】,标准对比法,即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。,A,s,=Kc,s,A,x,=Kc,x,【3】,F,因子法,【2】 标准对比法As=Kcs,05 十一月 2024,80,二、有机化合物结构辅助解析,1. 由紫外谱图可获得的结构信息,（1）200-400,nm,无吸收峰。饱和化合物，单烯，非共轭烯。,（2） 270-350,nm,有吸收峰（,=10-100,）醛酮,n,*,跃迁产生的,R,带。,（3） 250-300,nm,有中等强度的吸收峰（,=200-2000,），芳环的特征 吸收（具有精细解构的,B,带）。,（4） 200-250,nm,有强吸收峰（,10,4,），表明含有一个共轭体系（,K,）带。共轭二烯：,K,带（,230 nm,）；,不饱和醛酮：,K,带,230 nm,，,R,带,310-330 nm,260nm,300 nm,330 nm,有强吸收峰，,3,4,5,个双键的共轭体系。,07 十月 202380二、有机化合物结构辅助解析1. 由,05 十一月 2024,81,2,.,光谱解析注意事项,(1),确认,max,，,并算出,，初步估计属于何种吸收带；,(2),观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系；,(3),乙酰化位移,B,带：,262 nm(,302) 274 nm(,2040) 261 nm(,300),(4),pH,值的影响,加,NaOH,红移酚类化合物，烯醇。,加,HCl,兰移苯胺类化合物。,07 十月 2023812.光谱解析注意事项(1) 确认m,05 十一月 2024,82,3.,分子不饱和度的计算,定义：不饱和度是指分子结构中达到饱和所缺一价元素的“对”数。如：乙烯变成饱和烷烃需两个氢原子，不饱和度为,1,。,计算： 若分子中仅含一，二，三，四价元素,(H,，,O,，,N,，,C),，则可按下式进行不饱和度的计算：,=,（,2 + 2,n,4,+,n,3,n,1,）,/ 2,n,4,，,n,3,，,n,1,分别为分子中四价，三价，一价元素数目。,作用： 由分子的不饱和度可以推断分子中含有双键，三键，环，芳环的数目，验证谱图解析的正确性。,例：,C,9,H,8,O,2,=,（,2 +29, 8,）,/ 2 = 6,07 十月 2023823. 分子不饱和度的计算定义：不饱和,05 十一月 2024,83,4.,解析示例,有一化合物,C,10,H,16,由红外光谱证明有双键和异丙基存在，其紫外光谱,max,=231,nm,（,9000,）,，,此化合物加氢只能吸收,2,摩尔,H,2,，,，确定其结构。,解：计算不饱和度,= 3；,两个双键；共轭？加,2,摩尔氢,max,=231 nm,，,可能的结构,计算,max,max,：,232 273 268 268,max,=,非稠环二烯（,a,b,）,+2 ,烷基取代,+,环外双键,=217+25+5=232（231）,07 十月 2023834. 解析示例 有一化合,05 十一月 2024,84,吸收波长计算,07 十月 202384吸收波长计算,05 十一月 2024,85,立体结构和互变结构的确定,顺式：,max,=280nm,；,max,=10500,反式：,max,=295.5 nm,；,max,=29000,共平面产生最大共轭效应，,max,大,互变异构,：,酮式：,max,=204 nm,；无共轭,烯醇式：,max,=243 nm,07 十月 202385立体结构和互变结构的确定顺式：ma,05 十一月 2024,86,取代苯吸收波长计算,07 十月 202386取代苯吸收波长计算,05 十一月 2024,87,例,1,：,如图是混合物中分离出的四种化合物的紫外光谱。已知四种化合物结构如下，找出各结构式与光谱的对应关系。,A,B,C,D,HO,HO,AcO,C,8,H,17,C,8,H,17,C,8,H,17,C,8,H,17,四种化合物的紫外吸收光谱,07 十月 202387例1：如图是混合物中分离出的四种化合,解：,A,只有孤立双键，其,*,跃迁,max,在,200nm,以下。因图中,（,）,max,200nm,，故（,）为化合物,A,。,B,的,max,可以计算：基本值,253nm,两个环外双键（,25,）,10nm,+)4,个,R(45) 20nm,283nm,图中（,）,max,=280nm,（,），与,B,对应。按同样,方法，可以判定曲线（,）与,C,对应，曲线（,）与,D,对应。,例,2,：,药物中杂质的检查。,利用紫外光谱不仅可以检查药物中杂质，也可用于高纯化学试剂中杂质含量的监控。,13,解：A只有孤立双键，其 *跃迁max在200nm,1.,蛋白质的分析,2.,核酸的分析,3.,微生物代谢产物的测定,4.,药物分析的应用,例1.,Folin-,酚法测定蛋白含量,例2.考马斯亮蓝法测定蛋白含量,三、 紫外-可见分光光度法在生化分析中的应用,1.蛋白质的分析三、 紫外-可见分光光度法在生化分析中的应用,生物化学仪器分析-紫外ppt课件,05 十一月 2024,91,3.2,紫外分光光度计,Ultraviolet spectrometer,一、基本组成,general process,二、分光光度计的类型,types of spectrometer,07 十月 2023913.2 紫外分光光度计Ultr,