临床生化检验方法学评价试验课件

,*,*,*,*,全国高等医药院校医学检验专业规划教材,临床生物化学检验实验指导 （第二版）,单击此处编辑母版标题样式,*,*,全国高等医药院校医学检验专业规划教材,临床生物化学检验实验指导 （第二版）,实验,27,临床生化检验方法学评价试验,贵阳医学院医学检验系,黄海,实验,27,临床生化检验方法学评价试验,.,1,贵阳医学院医学检验系黄海实验 27 .1,实验目的,掌握：,方法学评价试验的原理和基本方法及统计分析,熟悉：,方法学评价试验的具体操作。,.,2,实验目的 掌握：方法学评价试验的原理和基本方法及统计分析,一、重复性实验,二、回收试验,三、干扰试验,四、方法比较试验,五、方法性能决定图绘制,六、最低检测限实验,.,3,一、重复性实验二、回收试验 三、干扰试验四、方法比较试验五、,实验原理,批内重复性试验是指在同一条件下（用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变）对同一标本在尽可能短的时间内进行,m,轮，每轮,n,次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映测定方法的随机误差大小。,一、重复性实验,.,4,实验原理 批内重复性试验是指在同一条件下,试剂与器材,1.,标本 采用血糖浓度约为,6.7mmol/L,的血清,标本（收集无溶血、无脂浊、无肝炎病毒,污染的人混合血清或动物血清）。,2. GOD-POD,试剂盒。,.,5,试剂与器材 1. 标本 采用血糖浓度约为6.7mmo,操作步骤,将血清标本用,GOD-POD,法作,5,轮，每轮,4,次血糖测定，即可获得,20,个测定数据。,.,6,操作步骤 将血清标本用GOD-POD法作,计算,1.,检验,20,次测定数据中的离群值 如存在异常值时应剔除。对小样本测定来讲，可采用,Grubbs,检验，,该方法是最合理的检验方法,。,.,7,计算1. 检验20次测定数据中的离群值 如存在异常值时应剔除,计算,用,Grubbs,检验准则，检验离群值的统计学公式是：,式中，,Xd,为离群值；,X,为包括离群值在内的测定值的均数；,s,为包括离群值在内的测定值的标准差,.,8,计算 用Grubbs检验准则，检验离,如计算的,G,值大于系数表中相应显著水平的,a,和测定次数,n,时的临界值,Ga.n,，则将,X,d,作为异常值舍弃，可按下列三种情况来处理：,（,1,）只有一个离群值的情况：设有,n,个测定数（,X,1,X,2,X,3,X,4,Xn,）其中,X,1,为离群值，即可利用上述公式，直接对,X,1,进行检验。,计算,.,9,如计算的G值大于系数表中相应显著水平的a和测定次数,（,2,）如果离群值是两个或两个以上，但都分布在均数,X,的同一侧，例如,X,1,、,X,2,都是离群值，则首先检验最内侧的一个数据（,X,2,），即通过检验,G,2,来决定,X,2,是否应该放弃。如果,X,2,应该放弃，,X,1,自然也应该放弃。如果,X,2,不应舍去，则再检验,X,1,。但在检验,X,1,时测定次数不应作为少了一次。,计算,.,10,（2）如果离群值是两个或两个以上，但都分布在均数X的同一侧，,（,3,）如果离群值有两个或两个以上。而且又分布于均数两侧，例如,X,1,和,Xn,都属于离群值，则分别检验,X,1,和,Xn,，是否应该舍去。如果一个数据决定舍去，那么再检验另一个数据时，测定次数应该作为减少一次来处理；而且此时应该选择,99%,的置信水平。,计算,.,11,（3）如果离群值有两个或两个以上。而且又分布于均数两侧，例如,2.,按照批内精密度的计算公式计算,5,轮每轮,4,次测定值的平均数,(X),、标准差,(s),和变异系数（,CV%,）。,（,1,）,（,2,）,式中为,5,轮各次测定值的方差，即：公式,.,12,2. 按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均,首先计算出每轮测定值的均数、标准差（,Si,）及方差,S1,、,S2,、,S3,、,S4,，并将数值填入表,27-1,内，再将,5,轮,Si,总和代入公式即可算出批内标准差,Sw,。最后计算出变异系数（,CV%,）,表,27-1,批内重复性试验的数据处理,测定,批数,每轮测定次数（,n,）及测定值（,X,i,）,X,i,S,i,S,i,2,1,2,3,4,1,2,3,4,5,合计,.,13,首先计算出每轮测定值的均数、标准差（,注意事项,血糖的医学决定水平值为,2.8 mmol/L,、,6.7,mmol/L,和,8.9mmol/L,。分析物浓度应选择医学决定水平才更具价值。,2.,用于评价方法精密度的变异系数应该是剔除离群值后的计算结果。,.,14,注意事项血糖的医学决定水平值为2.8 mmol/L、6.7,评价,批内不精密度的判断限是,1/4,允许误差范围。,批间不精密度的判断限是,1/3,允许误差范围。,允许误差范围可以根据,CLIA88,规定的能力比对试验的,TEa,确定。,返回本实验目录,.,15,评价 批内不精密度的判断限是1/4允许误差范围。返回本实,实验原理,二、回收试验,回收试验是用以发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。,即通过测定,GOD-POD,法测定血糖的回收率，能较确切地判断该分析方法比例系统误差的有无或大小，从而评价方法的准确性。,.,16,实验原理 二、回收试验 回收试验是用以,试剂与器材,80mmol/L,葡萄糖标准液,生理盐水,3. GOD-POD,试剂盒,4.,血清标本 收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，先用,GOD-POD,法测定血糖浓度，再用生理盐水稀释血糖浓度至,2.2mmol/L,备用。,.,17,试剂与器材 80mmol/L葡萄糖标准液.17,操作步骤,1.,样品制备,基础样品：血清,0.9ml+0.1ml,生理盐水。,回收样品,：血清,0.9ml+0.01ml 80mmol/L,葡萄糖标准液,+0.09ml,生理盐水。,回收样品,：血清,0.9ml+0.06ml 80mmol/L,葡萄糖标准液,+0.04ml,生理盐水。,回收样品,：血清,0.9ml+0.09ml 80mmol/L,葡萄糖标准液,+0.01ml,生理盐水。,2.,血糖浓度测定 按,GOD-POD,法测定各制备样品的血糖浓度，每份样品作双份检测，结果取平均值,.,18,操作步骤 1.样品制备.18,计算,1.,加入浓度计算,2.,回收量计算,2.,回收率计算,将各项计算结果填入表,27-2,。,.,19,计算 1. 加入浓度计算.19,表,27-2,回收试验的数据处理,样品,测定浓度（,mmol/L,）,加入浓度（,mmol/L,）,回收浓度（,mmol/L,）,回收率,（,%,）,基础样品,回收样品,回收样品,回收样品,平均回收率,.,20,表27-2 回收试验的数据处理样品测定浓度（mmol/L）加,注意事项,1.,标本加入标准液后，总浓度应在该方法的分析,范围内。最好使被测标本的浓度达到医学决定水,平，血糖测定的医学决定水平为,2.8 mmol/L,、,6.7,mmol/L,、,8.9mmol/L,。,2.,纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的,10%,，若稀释过大，误差将发生改变。,3.,准确加量是本试验最主要的技术关键。,.,21,注意事项1. 标本加入标准液后，总浓度应在该方法的分析,评价,一般检验方法，要求回收率在,95105%,之间，最理想的回收率应为,100%,返回本实验目录,.,22,评价 一般检验方法，要求回收率在951,三、干扰试验,实验原理,干扰试验是测定特异性和干扰两者引起的误差。干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差，误差的实际大小随干扰物的浓度而异。,.,23,三、干扰试验实验原理 干扰试验是测定特异性,三、干扰试验,实验原理,选用尿酸作,GOD-POD,法测定血糖的干扰试验，尿酸可疑和,GOD,反应生成的,H,2,O,2,发生反应，使部分,H,2,O,2,不能参与第二步,POD,的耦联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。,尿酸对该反应有干扰，但不是尿酸被测定。,干扰试验既用于检测某方法的特异性，也用于检测干扰物质对方法的干扰作用，以评价分析方法的准确性。,.,24,三、干扰试验实验原理 选用尿酸作GOD,试剂与器材,1.,血清标本 收集血糖浓度为,6.7mmol/L,的混合血清（要求同回收试验）。,2. 9.0mmol/L,尿酸标准液。,3. GOD-POD,试剂盒。,.,25,试剂与器材1. 血清标本 收集血糖浓度为6.7mmol/L的,操作步骤,1.,样品制备,基础样品：血清,0.9ml+,蒸馏水,0.1ml,干扰样品,：血清,0.9ml+9.0mmol/L,尿酸标准液,0.05ml+,蒸馏水,0.05ml,干扰样品,：血清,0.9ml+9.0mmol/L,尿酸标准液,0.1ml,尿酸样品：蒸馏水,0.9ml+9.0mmol/L,尿酸标准液,0.1ml,2.GOD-POD,法测定各样品血糖。,.,26,操作步骤1. 样品制备.26,计算,1.,干扰物加入值计算,2.,干扰值计算,3.,干扰率计算,.,27,计算1.干扰物加入值计算 .27,将各项计算结果填入表,27-3,内,表,27-3,干扰试验的数据处理,样 品,葡萄糖测定值（,mmol/L,）,加入尿酸值（,mmol/L,）,干扰值（,mmol/L,）,干扰率,（,%,）,基础样品,干扰样品,干扰样品,尿酸样品,.,28,将各项计算结果填入表27-3内表27-3 干扰试验的数据处理,注意事项,1.,可疑干扰物浓度 加入可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度的上限，最好达到病理标本的最高值，尿酸升高的变动范围在,0.42mmol/L0.9mmol/L,之间。,2.,干扰物对测定的影响与被分析物浓度无关，而与干扰物本身的浓度有关，所以产生的误差是恒定系统误差。,3.,其他注意事项与回收试验相同。,.,29,注意事项1. 可疑干扰物浓度 加入可疑干扰物的浓度应明显高于,评价,偏差,Bias,允许误差（,EA,）的临界值，表明由于干扰物引起的偏差对临床诊断和治疗不产生不良影响，是可以被接受的。,血,2.8mmol/,、,6.7 mmol/,和,8.9mmol/L,时的,EA,为,0.56mmol/L,。,返回本实验目录,.,30,评价 偏差Bias允许误差（EA）的临,四、方法比较试验,实验原理,用两种方法同时检测一批样本，计算出两种方法间测定结果的差异，用以估计试验方法在检测样本时可能引入的误差。当选择准确度已知的常规方法作为比较方法时，部分误差来自比较方法，其他部分误差则来自试验方法。若选择准确度高的参考方法作为比较方法，可把方法间的任何分析误差都归于试验方法。,本实验以,HK,法测定血糖的参考方法作对比来评价,GOD-POD,法测定血糖的总系统误差。,.,31,四、方法比较试验实验原理 用两种方法,试剂与器材,1. GOD-POD,法试剂盒,2. HK,法试剂试剂盒,3.,血清标本,40,份,（其浓度尽可能覆盖线性范围）。,.,32,试剂与器材1. GOD-POD法试剂盒.32,操作步骤,1.,取,40,份血清标本，每份标本用,GOD-POD,和,HK,两种方法，分别作双份测定。,2.,每次（天）测定,8,个标本，双份测定时第一次按顺序,1,，,2.7,，,8,，第二,8,，,7.2,，,1,，共测试,5,次（天）。并计算两法各自的测定结果。,.,33,操作步骤1. 取40份血清标本，每份标本用GOD-POD和H,计算,1.,将实验结果作散点图，图中以,x,轴代表比较方法的测定值，,y,轴代表实验方法的测定值，在坐标纸上作图应散布于整个测定范围之内。,通过散点图可以观察到，测定数据的分布趋势，若所有测定值在坐标图中大致呈,45,角的直线分布，提示被实验方法与比较方法的测定结果之间存在密切的相关关系；若呈明显的曲线分布，虽然在统计学上可按照非线性资料处理，但在这种情况下，实验方法被采用的可能性极小。,.,34,计算1. 将实验结果作散点图，图中以x轴代表比较方法的测定值,计算,2.,如果,x,、,y,之间呈直线关系，可作直线回归的统计处理，计算：,回归方程,y=a+bx,和相关系数,r,。,其结果可以显示实验方法的测定结果有无系统误差存在。,截距,a,反映恒定系统误差的大小；,斜率,b,反映比例系统误差的大小；,相关系数,r,反映两种方法相关性的密切程度。,.,35,计算2. 如果x、y之间呈直线关系，可作直线回归的统计处理，,在评价一个实验方法时，最理想的情况是回归直线呈,45,角通过零点，这时,a=0,，,b,（,x/y,比值）,=1.0,，表明恒定系统误差和比例系统误差均不存在。但,x,和,y,都会有随机误差，,a,和,b,只是估计值，会有所波动，只要偏离程度比较小，该方法就能用于临床检验的常规分析。,计算,.,36,在评价一个实验方法时，最理想的情况是回归直线,3.,根据计算出的回归方程的,a,、,b,值，可以计算候选方法系统误差（,SE,）的大小，并与不同医学决定水平（,Xc,）的允许误差（,EA,）作比较，对被评价方法的系统误差的可接受性作出判断。,SE,的可接受性判断指标为,血糖测定的,Xc=2.8 mmol/L,、,6.7mmol/L,、,8.9mmol/L,时，,Barnett,提出的,EA,值为,0.56mmol/L,。,计算,.,37,3. 根据计算出的回归方程的a、b值，可以计算候选方法系统误,作相关分析 在方法比较试验中，相关系数（,r,）可作为被评价方法可否被接受的一项统计学指标。对相关系数还应作相关系数的,t,检验。,相关系数（,r,）的,t,检验统计学公式是：,计算,.,38,作相关分析 在方法比较试验中，相关系数（r）可作为被评价方法,5.,方法比较试验的数据属于配对资料，因而可作配对,t,检验，其统计学公式是：,式中,:d,代表候选方法与参考方法测定值的差值,(,或正或负,),；,d,为差值之平均值；,n,为配对数。,计算,.,39,5. 方法比较试验的数据属于配对资料，因而可作配对t检验，其,在计算,t,值公式中的分子部分是两种方法的偏差值，表明方法间系统误差的大小。,分母是平均偏差标准误，反映方法比较实验中随机误差的大小。,因此,t,值时方法比较试验中系统误差和随机误差的比值。,计算,.,40,在计算t值公式中的分子部分是两种方法的偏差值，表,注意事项,1.,选择试验样品,一般作,40100,例，包括常规工作中可能遇到的整个分析范围（其中,25%,的标本低于参考范围下限，,50%,标本在参考范围之内，,25%,标本高于参考范围），选择合适的样品分析范围比增加样品的数目更为重要。,.,41,注意事项1. 选择试验样品 .41,注意事项,2.,试验方法,一般每个样品用两种方法各测一次，最好每个样品用两种方法各测定两次，在做双份第二次测定时，标本顺序应全部倒过来，最好在,4h,内完成。,3.,对比方法,对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法或决定性方法，这样方法间的任何分析误差都可归于被评价的候选方法。,返回本实验目录,.,42,注意事项2. 试验方法 返回本实验目录.42,五、方法性能决定图绘制,实验原理,准确度和精密度是检测系统的两大最主要的性能指标，二者结合就是总误差（,total error,，,TE,）。,当,TE,小于允许总误差（,allowable total error,，,TEa,）时，则检测系统的性能合格。,当,TE,大于,TEa,时，则检测系统的性能不可接受。,.,43,五、方法性能决定图绘制实验原理 准确度,五、方法性能决定图绘制,实验原理,目前，有三种计算误差,TE,的方式,（,bias,代表不准确度，,s,或,CV,代表不精密度）：,（,1,）,TE=bias+2sTEa,；或：,TE%=bias%+2CV%TEa%,（,2,）,TE=bias+3sTEa,；或：,TE%=bias%+3CV%TEa%,（,3,）,TE=bias+4sTEa,；或：,TE%=bias%+4CV%TEa%,.,44,五、方法性能决定图绘制实验原理目前，有三种计算误差TE的方式,应用,Westgard,方法决定图（,method decision chart, MDC,），将不准确度和不精密度以图像的形式表达，在图上与要求的质量作比较，结果简单明了。,根据以上几次的实验结果，应用,MDC,，可以对葡萄糖氧化酶法,(GOD-POD,法,),的性能作一综合性的评价。,五、方法性能决定图绘制,实验原理,.,45,应用Westgard方法决定图（met,操作步骤,1.,实验数据采用前面实验的结果。,重复性试验中得到的,CV,作为横坐标，然后利用方法比对实验中得到的回归方程,y=a+bx,，以重复性实验中标本均值为,Y,值，求出对应的,X,值，计算：,.,46,操作步骤1. 实验数据采用前面实验的结果。.46,操作步骤,2.,取坐标纸，按图,27-1,所示作图。,首先确定分析质量要求，以总允许误差,TEa,表示。,本实验血糖的,TEa,是,10%,，在坐标纸上定义,y,轴为允许不准确度（偏倚,%,），从,0,到,Tea,，最大刻度,10%,；,定义,x,轴为允许不精密度（,%,，即,CV,），从,0,到,0.5 TEa,，即最大刻度为,5%,。,.,47,操作步骤2. 取坐标纸，按图27-1所示作图。.47,从,y,轴的,TEa,（,10,）到,x,轴的,0.5TEa,（,5.0,）即过（,0,，,10.0,；,5.0,，,0,）两点画一直线，为,偏倚,+2s,线,。,从,y,轴的,TEa,（,10,）到,x,轴的,0.33TEa,（,3.3,）即过（,0,，,10.0,；,3.3,，,0,）两点画一条线，为,偏倚,+3s,线,。,从,y,轴的,TEa,（,10,）到,x,轴的,0.25TEa,（,2.5,）即过（,0,，,10.0,；,2.5,，,0,）两点画一直条线，为,偏倚,+4s,线,。,这三条分别把图划分成四个部分。,从上到下，分别代表性,能差区,、,临界性能区、性能良好区,和,性能优秀区,。,.,48,从y轴的TEa（10）到x轴的0.5TEa（5.0,3.,方法性能判定的不同水平结果 观察方法决定图上操作点的位置，判断方法性能。,四种可能分别为：,性能差,，表明该测定方法不能满足质量要求，对于常规操作不能被接受。,操作步骤,.,49,3. 方法性能判定的不同水平结果 观察方法决定图上操作点的, 临界性能,，表明该性能尽管能满足临床要求，但很可能失控，日常操作中，需要全面质量控制策略，增加训练有素的操作者，减少人员的轮转，增强仪器维护措施，小心监测病人检测结果，持续努力地改善方法性能。,操作步骤,.,50,操作步骤.50,良好,，表明该测定方法能满足质量要求，在日常工作中，只要小心计划统计质量程序且能运用每批,46,个控制测定值的多规则质控方案，测定方法就能被很好地进行管理。,优秀,，在日常工作中测定方法易于管理，只需最少的花费，通常每批,2,个控制测定个数，单规则的质控方案就能很好的控制。,操作步骤,.,51,良好，表明该测定方法能满足质量要求，在日常工作中，只要小心,临界性能,性能差,性能优秀,性能良好,图,27-1,允许总误差示意图,返回本实验目录,.,52,性能优秀图27-1 允许总误差示意图返回本实验目录.52,六、最低检测限实验,实验原理,选择合适的空白标本，该标本与待测标本的区别在于不含有待测物质。,事实上，除了药物测定外（因药物不存在正常体液中），其他空白标本只能近似于要求的条件。,一般用处理过的标本，如破坏或移除标本中的待测物，或用一般标本只是在分析步骤中省去关键的试剂或操作。,本试验采用后者，在,GOD-POD,法测血糖试剂中省去的,GOD,试剂，其他试剂不变，经多次测定，求出吸光度的均数和标准差，计算检出限。,.,53,六、最低检测限实验实验原理 选择合适的空,试剂与器材,在,GOD-POD,法测定血糖的酶混合液试剂中除去,GOD,，其他试剂的组成成分及浓度不变。,.,54,试剂与器材 在GOD-POD法测定血糖的,操作步骤,以蒸馏水作空白，取血清标本，用除去,GOD,的酶混合试剂，按,GOD-POD,法测血糖的操作步骤作,20,次测定，记录,20,次测定的吸光度。,.,55,操作步骤 以蒸馏水作空白，取血清标本，,计算,1.,计算,20,次测定的平均吸光度及标准差（,s,）， 其标准差即为低范围时的不精密度。,2.,检测低限计算,95%,可能性 平均吸光度,+2s,97.5%,可能性 平均吸光度,+3s,.,56,计算1. 计算20次测定的平均吸光度及标准差（s）， 其标准,注意事项,最低检测限量可以表示实验方法的灵敏度。,但二者的概念不同，检测限反映了方法对空白样本测定的不确定度，是一种分析方法的最大检测能力的指标，更具实用性。,但灵敏度与取样体积、分析方法及最后闭塞或检测需要量都有密切关系。,返回本实验目录,.,57,注意事项 最低检测限量可以表示实验方法,思考题,1.,重复性试验依据时间间隔可分为几种？哪种最符合临床实际？,2.,重复性试验结果反映了什么误差？,3.,计算变异系数为何要剔除离群值？,4.,什么是回收率？回收率怎样计算？,5.,为什么加入标准液的体积要控制在,10%,以内？,6.,请简述干扰与特异性的概念，怎样用实验来加以区分？,7.,干扰试验和回收试验的样品制备有何异同？,8.,干扰试验反映的是何种误差？干扰率怎样计算？,.,58,思考题 1. 重复性试验依据时间间隔可分为几种？哪种最符合临,9.,方法比较试验反映的是何种误差？比较方法为,何要用参考方法或决定性方法？,10.,用于方法学比较试验的标本例数和浓度各有,什么要求？,11.,做方法比较试验应注意哪些事项？,.,12.,偏倚,+2s,、偏倚,+3s,、偏倚,+4s,线，三条线把,MDC,分成哪几部分，每一部分分别代表什么,涵义？,13.,什么叫检测限？最低检测限能反映方法的何,种性能？,思考题,.,59,9. 方法比较试验反映的是何种误差？比较方法为思考题 .5,谢谢！,返回总目录,.,60,谢谢！返回总目录.60,