三少__12基因工程的基本操作步骤

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,1,、,、,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,获,获,取,取,2,、,、,基,基,因,因,表,表,达,达,载,载,体,体,的,的,构,构,建,建,3,、,、,将,将,目,目,的,的,基,基,因,因,导,导,入,入,受,受,体,体,细,细,胞,胞,4,、,、,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,检,检,测,测,与,与,鉴,鉴,定,定,基,因,因,工,工,程,程,基,基,本,本,操,操,作,作,的,的,四,四,个,个,步,步,骤,骤,有,了,了,目,目,的,的,基,基,因,因,，,，,我,我,们,们,才,才,能,能,赋,赋,予,予,一,一,种,种,生,生,物,物,另,另,一,一,种,种,生,生,物,物,的,的,遗,遗,传,传,特,特,性,性,一,、,、,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,获,获,取,取,1,、,、,目,目,的,的,基,基,因,因,主,主,要,要,是,是,指,指_,编,码,码,蛋,蛋,白,白,质,质,的,的,结,结,构,构,基,基,因,因,基,因,因,是,是,什,什,么,么,结,结,构,构?,2,、,、,获,获,取,取,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,常,常,用,用,方,方,法,法,（1,）,）,从,从,基,基,因,因,文,文,库,库,中,中,获,获,取,取,（2,）,）,利,利,用,用PCR,技,技,术,术,扩,扩,增,增,（3,）,）,人,人,工,工,合,合,成,成,原,核,核,细,细,胞,胞,的,的,基,基,因,因,结,结,构,构(,补,补,充,充,内,内,容,容,）,）,非,编,编,码,码,区,区,非,编,编,码,码,区,区,编,码,码,区,区,编,码,码,区,区,上,上,游,游,编,码,码,区,区,下,下,游,游,与RNA,聚,聚,合,合,酶,酶,结,结,合,合,位,位,点,点,启,动,动,子,子,终,止,止,子,子,不,不,编,编,码,码,蛋,蛋,白,白,质,质,。,。,：,编,编,码,码,蛋,蛋,白,白,质,质,连,连,续,续,不,不,间,间,断,断,编,码,码,区,区,非,编,编,码,码,区,区,原,核,核,细,细,胞,胞,的,的,基,基,因,因,结,结,构,构,调控,遗,遗传信,息,息表达,上,游有启,动,动子，,下,下游有,终,终止子,启动子,真核细,胞,胞的基,因,因结构,（,（补充,内,内容）,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合,酶,酶,结合位,点,点,内含,子,子,外显,子,子,启动,子,子,终止,子,子,编码,区,区上,游,游,编码,区,区下,游,游,真核,细,细胞,的,的,基,基,因,因结,构,构,编码,区,区,非编,码,码区,外显,子,子：,能,能编,码,码蛋,白,白质,的,的序,列,列,内含,子,子：,不,不能,编,编码,蛋,蛋白,质,质的,序,序列,：,有调,控,控作,用,用,上,上游,有,有启,动,动子,，,，下,游,游有,终,终止,子,子,非编,码,码序,列,列：,包括,非,非编,码,码区,和,和内,含,含子,非编,码,码区,非编,码,码区,编码,区,区,RNA聚,合,合酶,结,结合,位,位点,外显,子,子,内含,子,子,终止,子,子,基因,的,的结,构,构,启动,子,子,原核,真核,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,原核,细,细胞,与,与真,核,核细,胞,胞的,基,基因,结,结构,比,比较,连续,不连,续,续,编码,区,区,非编,码,码,一、,目,目的,基,基因,的,的获,取,取,1、目的,基,基因主要,是,是指_,编码蛋白,质,质的结构,基,基因,基因是什,么,么结构?,2、获取,目,目的基因,的,的常用方,法,法,（1）从,基,基因文库,中,中获取,（2）利,用,用PCR,技,技术扩增,（3）人,工,工合成,(1)从,基,基因文库,中,中获取目,的,的基因,什么是基,因,因文库？,什么是基,因,因组文库,？,？,什么是部,分,分基因文,库,库？,怎样从基,因,因文库中,得,得到我们,所,所需的目,的,的基因？,概念：基因文库,（gene library）,基因组文库,部分基因文库,（如cDNA文库）,将含有某,种,种生物不,同,同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中,储,储存,各个受体菌分,别,别含有这,种,种生物的,不,不同的基,因,因,称为,基,基因文库(gene library),基因组文,库,库:,基因文库,中,中包含了,一,一种生物所有的基,因,因,这种基,因,因文库叫,做,做基因组,文,文库.,部分基因,文,文库:,基因文库,中,中包含了,一,一种生物,的,的一部分基因,这种基因文库,叫,叫做部分基因文,库,库.,提取某种生物的,全,全部DNA,用适当的限制酶,切,切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与,载,载体连接,导入受体菌中储,存,存,基因组文库,基因文库的构建,方,方法,（1）直接分离,法,法(鸟枪法),某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片,段,段,导入受体菌中储,存,存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,（2）反（逆）,转,转录法：cDNA的合成流程图,解,解,基因文库的构建,方,方法,某种生物某个时,期,期的mRNA,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接 导入,cDNA文库,一、目的基因的,获,获取,1、目的基因主,要,要是指_,编码蛋白质的结,构,构基因,请举出三个以上,的,的例子,2、获取目的基,因,因的常用方法,（1）从基因文,库,库中获取,（2）利用PCR技术扩增,利用PCR技术,扩,扩增目的基因,PCR,聚合酶链式,反,反应,是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，,可,可获取大量的目,的,的基因。,PCR技术,原理：,前提：,原料,方式,PCR扩增仪,DNA复制,一段已知目的基,因,因的核苷酸序列,：以_,方,方式扩增，,即_（n,为,为扩增循环的次,数,数）,指数,2,n,模板DNA；DNA引物；四种,脱,脱氧核苷酸；热,稳,稳定DNA聚合,酶,酶（Taq酶）,过程,变性、退火、延,伸,伸三步曲,变性：,加热至,90,95,双链DNA解链,成,成为单链DNA,退火：,冷却至,55,60,部分引物与模板,的,的单链DNA的,特,特定互补部位相,配,配对和结合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因为模,板,板，合成互补的,新,新DNA链,变性,退火,延伸,2、具体过程,一、目的基因的,获,获取,1、目的基因主,要,要是指_,编码蛋白质的结,构,构基因,基因是什么结构?,2,、,、,获,获,取,取,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,常,常,用,用,方,方,法,法,（1,）,）,从,从,基,基,因,因,文,文,库,库,中,中,获,获,取,取,（2,）,）,利,利,用,用PCR,技,技,术,术,扩,扩,增,增,（3,）,）,人,人,工,工,合,合,成,成,人,工,工,合,合,成,成,根,根,据,据,已,已,知,知,的,的,氨,氨,基,基,酸,酸,序,序,列,列,合,合,成,成DNA,蛋,白,白,质,质,的,的,氨,氨,基,基,酸,酸,序,序,列,列,mRNA,的,的,核,核,苷,苷,酸,酸,序,序,列,列,结,构,构,基,基,因,因,的,的,核,核,苷,苷,酸,酸,序,序,列,列,推,测,测,推,测,测,目,的,的,基,基,因,因,化,学,学,合,合,成,成,1,、,、,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,获,获,取,取,2,、,、,基,基,因,因,表,表,达,达,载,载,体,体,的,的,构,构,建,建,基,因,因,工,工,程,程,基,基,本,本,操,操,作,作,的,的,四,四,个,个,步,步,骤,骤,使,目,目,的,的,基,基,因,因,在,在,受,受,体,体,细,细,胞,胞,中,中,稳,稳,定,定,存,存,在,在,，,，,并,并,可,可,进,进,行,行,遗,遗,传,传,、,、,表,表,达,达,和,和,发,发,挥,挥,作,作,用,用,3,、,、,将,将,目,目,的,的,基,基,因,因,导,导,入,入,受,受,体,体,细,细,胞,胞,4,、,、,目,目,的,的,基,基,因,因,的,的,检,检,测,测,与,与,鉴,鉴,定,定,二,、,、,基,基,因,因,表,表,达,达,载,载,体,体,的,的,构,构,建,建,核,核,心,心,（1,）,）,用,用,一,一,定,定,的,的_,切,切,割,割,质,质,粒,粒,，,，,使,使,其,其,出,出,现,现,一,一,个,个,切,切,口,口,，,，,露,露,出,出_,。,。,（2,）,）,用,用_,切,切,断,断,目,目,的,基,基,因,因,，,，,使,使,其,其,产,产,生,生_,_,。,。,（3）将切下的,目,目的基因片段插,入,入质粒的_处，再加,入,入适量_,，,，形成了一个重,组,组,DNA分子（重,组,组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,基因表达载体的,构,构建,核心,质粒,DNA分子,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子,（,（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载,体,体的结合过程，,实,实际上是不同来,源,源的基因重组的,过,过程。,2、基因表达载体的作用,a、使目的基因,在,在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的,基,基因能表达和发挥作用,思考：,作为基因工程表,达,达载体，只需含,有,有目的基因就可,以,以完成任务吗？,为,为什么？,基因表达载体的,组,组成：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA聚,合,合酶结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是,否,否导入受体细胞,它们有什么作用,？,？,1、目的基因的,获,获取,2、基因表达载,体,体的构建,3、将目的基因,导,导入受体细胞,基因工程基本操,作,作的四个步骤,载体进入受体细,胞,胞稳定表达，才,能,能实现一种生物,的,的基因在另一种,生,生物中的转化。,常用的受体细胞,：,：,有大肠杆菌、枯,草,草杆菌、土壤农,杆,杆菌、酵母菌和,动,动植物细胞等。,将目的基因导入,受,受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染,细,细胞的途径,。,。,三、将,目,目的基,因,因导入,受,受体细,胞,胞,1、,将目的,基,基因导,入,入植物,细,细胞,（1）,农,农杆菌,转,转化法,特点:,能感染双子叶,植,植物和祼子植,物,物,对单,子,子叶植,物,物无感,染,染能力,Ti质,粒,粒的TDNA,可,可转移,至,至受体,细,细胞并,整,整合到,其,其染色,体,体上,转化过,程,程:,Ti质,粒,粒,目的基,因,因,构建,表达载,体,体,导入,植物细,胞,胞,插入,植物细,胞,胞染色DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,（2）,基,基因枪,法,法,基因枪,法,法又称,微,微弹轰,击,击法，,是,是利用,压,压缩气,体,体产生,的,的动力,，,，将包,裹,裹在金,属,属颗粒,表,表面的,表,表达载,体,体DNA打入,受,受体细,胞,胞中，,使,使目的,基,基因与,其,其整合,并,并表达,的,的方法,。,。,（3）花粉,通,通道法,植物花粉在,柱,柱头上萌发,后,后，花粉管,要,要穿过花柱,直,直通胚囊。,花,花粉管通道,法,法就是在植,物,物受粉后，,花,花粉形成的,花,花粉管还未,愈,愈合前，剪,去,去柱头，然,后,后，滴加DNA（含目,的,的基因），,使,使目的基因,借,借助花粉管,通,通道进入受,体,体细胞。,2、将目的,基,基因导入动,物,物细胞,方法：显微,注,注射法,程序：,目的基因表,达,达载体提纯,取,取卵（,受,受精卵）,显,显微,注,注射,受,受精,卵,卵,新,